肠炎沙门氏菌Hfq和非编码小RNA IsrE、STnc640毒力相关功能研究

摘要

细菌非编码小RNA(sRNA)可在转录后水平调节基因的表达，是近年来新发现的一类基因调节子。沙门氏菌作为肠道病原菌，其毒力机制、微生物致病机制、基因表达和代谢途径等已得到深入研究，近年来已成为研究RNA介导调控的模式病原菌。鉴于sRNA在调控沙门氏菌生长代谢和致病性等方面发挥十分重要的作用，但大多数sRNA的功能和其靶标基因还不清楚。本研究对肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq以及Hfq依赖性sRNAIsrE和STnc640的毒力相关调控功能进行了如下研究。
　　1肠炎沙门氏菌sRNA伴侣蛋白Hfq毒力相关功能研究
　　肠炎沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，可引起人和动物肠道或全身性疾病。细菌sRNA伴侣蛋白Hfq能介导sRNA结合到靶标mRNA上，促进sRNA完成转录后调控。本研究通过λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌50336 hfq基因缺失株50336△hfq，并构建了回补株50336△hfq/phfq。通过qRT-PCR检测了主要菌毛亚单位sefA、bcfA、fimA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA，外膜蛋白ompD和鞭毛蛋白fliC的表达。结果显示，相比野生株50336，50336△hfq中sefA的表达水平上调约14倍，ompD上调约2.7倍，其余的菌毛亚单位和fliC的表达均下调明显。运动性试验结果显示50336△hfq的运动能力与野生株相比明显下降。同时黏附试验结果表明，相比50336，50336△hfq对Caco-2的黏附能力下降明显。50336、50336△hfq和50336△hfq/phfq对一日龄雏鸡的半数致死量LD50分别为9.472×108、2.442×109和2.974×108 CFU，表明50336△hfq对雏鸡的毒力减弱。根据以上结果，推测Hfq可通过调控菌毛相关基因、外膜蛋白ompD和鞭毛亚单位fliC的表达影响细菌的毒力。
　　2肠炎沙门氏菌sRNA IsrE毒力相关功能研究
　　sRNA IsrE由沙门氏菌毒力岛编码，在侵染巨噬细胞时表达量上升。本研究通过λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌50336 isrE基因缺失株50336△isrE，并构建了回补株50336△isrE/pisrE。生长曲线测定结果显示，50336△isrE和野生株的生长速率无明显差别，qRT-PCR检测到IsrE水平在稳定后期达到最高。利用qRT-PCR检测了主要菌毛亚单位sefA、bcfA、fimA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA，外膜蛋白ompD和鞭毛蛋白fliC的表达。结果显示，相比野生株50336，50336△isrE中fimA、sefA、stbA、sthA、csgA、csgD、外膜蛋白ompD和鞭毛亚单位fliC表达均表现下调。ompD表达下调95％，推测其可能是IsrE的直接靶标基因。运动性试验结果显示，与野生株相比，50336△isrE的运动能力下降。同时黏附试验结果显示，相比50336，50336△isrE对Caco-2的黏附能力减弱。50336、50336△isrE和50336△isrE/pisrE对一日龄雏鸡的半数致死量LD50分别为2.901×108，4.084×108和3.101×108 CFU，表明50336△isrE对雏鸡的毒力减弱。IsrE对Hfq的依赖性检测结果显示，50336△hfq中IsrE水平只有野生株的30％，推测isrE可能在Hfq的协助下，通过调控外膜蛋白ompD并影响菌毛、鞭毛以及其他未知靶标基因的表达影响细菌的毒力。
　　3肠炎沙门氏菌sRNA STnc640毒力相关功能研究
　　STnc640为鼠伤寒沙门氏菌中新发现的一种sRNA，具有Hfq依赖性，但其功能未知。通过TargetRNA软件发现bcfA和fimA可能是STnc640的靶标基因，推测其可能对菌毛介导的细菌毒力具有调控作用。本研究通过λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门氏菌50336stnc640基因缺失株50336△stnc640，并构建了回补株50336△stnc640/pstnc640。生长曲线测定结果显示，50336△stnc640和野生株的生长速率无明显差别，同时qRT-PCR检测到STnc640水平在稳定后期达到最高。利用qRT-PCR检测了主要菌毛亚单位sefA、bcfA、fimA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、pegA，外膜蛋白ompD和鞭毛蛋白fliC的表达。结果显示，相比50336，50336△stnc640中fimA、sefA、csgD和外膜蛋白ompD均表现下调。同时黏附试验结果显示，相比50336，50336△stnc640对Caco-2的黏附能力上升。50336、50336△stnc640和50336△stnc640/pstnc640对一日龄雏鸡的半数致死量LD50分别为2.901×108，2.124×108和5.054×108CFU，表明50336△stnc640对雏鸡的毒力增强。推测stnc640通过影响菌毛fimA、sefA、csgD、外膜蛋白ompD以及调控其他未知靶标基因的表达的表达影响细菌的毒力。STnc640对Hfq的依赖性检测结果显示，50336△hfq中STnc640水平只有野生株的2％，表明Hfq缺失显著降低了STnc640的稳定性。