江苏地区猪圆环病毒2型的分离鉴定和嵌合型PCV1-2 206佐剂灭活苗对商品猪的免疫保护研究

摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是引起猪圆环病毒病(porcinecircovirus associated diseases，PCVAD)的主要病原，是继猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductive and respiratory syndrome，PRRS)之后发现的又一重要疫病。自1997年Clark等首次分离到PCV2以来，该病已给世界养猪业造成了巨大的经济损失。在2008年第20届国际猪病大会(The20th International Pig Veterinary Society Congress，20th IPVS)上，曾将其列为危害养猪业发展的头号疫病。我国自2000年郎洪武首次报道猪群中存在PCV2抗体以来，各地陆续报道，表明感染范围已波及全国。
　　本文旨在检测江苏部分猪场PCV2的流行情况，为PCV2相关疾病的防制提供参考。同时，用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒1-2型DNA克隆电转染Dulac细胞，获得嵌合型PCV1-2病毒。将该病毒灭活后以206佐剂乳化制备灭活苗免疫无PCV2母源抗体的商品猪，并对免疫猪攻击PCV2。通过对免疫攻毒猪的相关指标进行观察、分析，以评价该灭活疫苗对于预防PCV2感染的有效性。
　　1猪圆环病毒2型的分离鉴定
　　在扬州某规模化屠宰场（屠宰猪来自江苏部分地区）进行采样，通过PCR方法检测样品中PCV2的DNA。阳性样品作PCV2的分离，对分离到的5株PCV2进行全序列测定。
　　对全基因组进行测序后发现，分离到的5个PCV2分离株的基因组全长均为1767bp，ORF2序列全长为705 bp。5个分离株之间的DNA序列同源性高，为99.6～99.7％。系统发生树显示5个分离株均属PCV2 group1亚型，即PCV2b。其亲缘关系近，属进化树的同一个微小分支。广东分离株group1C和荷兰分离株group1C与它们的同源性最为接近，同属于一个大的分支。流行病学调查表明，PCV2 group1即PCV2b已成为目前江苏地区流行的优势毒株。为研究本地区PCV2的遗传和变异，探索PCV2的遗传进化关系等提供了材料。
　　2嵌合型PCV1-2病毒灭活苗对商品猪感染PCV2免疫保护效力的研究
　　本文运用多功能细胞电穿孔仪将本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒1-2型DNA克隆转染Dulac细胞，传代培养后收获嵌合型猪圆环病毒PCV1-2。将该重组病毒灭活后与206佐剂乳化制成灭活苗，免疫42日龄的PCV2母源抗体阴性商品猪，一免后21天加强免疫一次，第二次免疫后14天攻击PCV2毒株。
　　结果表明，二免后14天，所有免疫组试验猪都表现为血清学阳性，可检测到高滴度的PCV2特异荧光抗体，且中和抗体效价水平在1/15～1/20。攻毒后21天扑杀试验猪并剖检，免疫组猪的淋巴结和各脏器的大体和显微病变都比攻毒对照组轻微。攻毒对照组猪的淋巴结出现多核巨细胞和嗜酸性粒细胞，且有大量的淋巴细胞缺失，免疫组未见多核巨细胞，淋巴细胞缺失也少见。荧光定量PCR测得腹股沟淋巴结中PCV2病毒载量在攻毒对照组为5.566±0.432，在104.0 TCID50、1050 TCID50、106.0 TCID50免疫组分别为4.469±1.023、4.434±0.716、3.521±0.958，其中105.0 TCID50、106.0 TCID50免疫组与攻毒对照组差异显著(P＜0.05)。综上所述，嵌合型猪圆环病毒PCV1-2灭活苗可以有效地诱导免疫猪产生针对PCV2感染的保护性免疫应答。