流产布氏杆菌脂多糖突变株△rfbE和△rfbD的构建及其生物学特性研究

摘要

布氏杆菌是兼性胞内生长的革兰氏阴性菌，可感染多种动物和人，引起布氏杆菌病。布氏杆菌的致病机制与其胞内存活、增殖有关。脂多糖(LPS)是布氏杆菌一种重要的毒力因子，完整的LPS对其胞内生存和毒力十分必要。rfbE(BAB1_0542)编码ABC型转运系统ATP酶，rfbD(BAB1_0543)编码ABC型转运系统运载体，这两个蛋白参与LPS的O-抗原从细胞膜内侧转运到周质侧。rfbE、rfbD基因突变，将导致O-抗原在胞内合成，但不能转运到周质侧，无法合成完整的LPS。
　　本研究通过同源重组的方法构建△rfbE和△rfbD突变株，通过比较突变株和野毒株的细菌表型、生长曲线、在小鼠巨噬细胞RAW264.7胞内生存能力、在BALB/c小鼠动物模型上的毒力情况，来探讨不完整LPS结构对布氏杆菌S2308生物学功能和毒力特性的影响;并通过监测△rfbE免疫后小鼠血清针对S2308产生的抗体效价、细胞因子表达，小鼠脾脏内MHC分子和共刺激分子在转录水平的表达，以及△rfbE免疫后小鼠对S2308攻毒产生的保护力，来评价△rfbE免疫保护性，探究其做为新型减毒活疫苗候选株的可能性。
　　结果显示，△rfbE和△rfbD突变株构建成功，rfbE基因(BAB1_0542)编码框内缺失446 bp，rfbD基因(BAB1_0543)编码框内缺失668 bp。同时用实时定量PCR方法在转录水平上验证△rfbE突变成功，对上下游基因功能没有影响。应用结晶紫染色和热凝集实验方法确定△rfbE和△rfbD均为粗糙型表型;生长曲线结果表明△rfbE突变株生长速度于36 h后明显低于野毒株S2308(P＜0.01)，△rfbD突变株比野毒株S2308早8h到达平台期;△rfbE对大多数抗生素敏感，仅对红霉素不敏感，对表面活性剂Tween-20、Triton-X100不敏感，与野毒株S2308相比差异不显著;△rfbE和△rfbD突变株与野毒株S2308相比，在胞内的生存、增殖能力下降，在小鼠体内毒力减弱，而C2308△rfbE与野毒株S2308毒力一致。
　　此外，△rfbE免疫2周后针对S2308产生抗体效价明显低于S2308接种小鼠产生的效价（P＜0.05），可以区分人为免疫和自然感染;△rfbE免疫小鼠1周后脾脏内MHCⅠ的表达量明显上调(P＜0.05)，而野毒株S2308免疫小鼠1周后脾脏内MHCⅠ的表达量上调不明显，突变株△rfbE相对于野毒株S2308在免疫早期引起更高水平的细胞免疫水平;△rfbE、S2308免疫后脾脏中共刺激分子CD40、CD80、CD86调节趋势一致，血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10变化不明显，即△rfbE、S2308产生免疫分子的趋势一致;△rfbE免疫小鼠后对强毒的攻毒保护率为100％，与疫苗株RB51相似。因此，△-fbE可作为新型减毒活疫苗的候选株。