绵羊YAP1基因与肌肉生长相关基因表达相关分析以及载体构建的研究

摘要

本实验以湖羊为研究对象，利用基因克隆技术克隆绵羊YAP1基因cDNA全长序列，并利用生物学分析软件对绵羊YAP1基因与其他物种的同源性，其蛋白的理化性质，二级结构和三级结构进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术对绵羊YAP1基因在出生后二日龄，二月龄和六月龄不同公母在四种不同骨骼肌（背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌）的相对表达进行了分析;并利用RT-PCR、载体构建和定点突变技术，构建了pEGFP-C1-YAP1，及其磷酸化位点突变体pEGFP-C1-YAP1 S42A真核表达载体。旨在探索YAP1在绵羊出生前和出生后肌肉生长过程中的调控机制，为湖羊肌肉生长性状的选育提供遗传学资料。本研究获得了一下结果:
　　1.克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1712 bp，其中包括编码区1212bp，5' UTR27bp和3' UTR473bp，共编码403个氨基酸。同源性分析发现，绵羊YAP1核苷酸序列与推测的氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高，分别达到78.77％和92.51％，而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析得到，绵羊YAP1基因编码蛋白为水溶性蛋白，相对分子量为44079.0Da，理论等电点为4.91，无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核，不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点，7个糖基化位点，具有两个WW结构域，二级结构以无规则卷曲为主，三级结构显示，YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。
　　2.绵羊YAP1基因在不同肌肉中的表达存在显著差异，其中在腓肠肌中相对表达最高，在背最长肌中最低，在不同生长阶段（二日龄、二月龄和六月龄）的比较中，YAP1的表达随月龄的增加而升高。YAP1在公母间表达的差异不显著。YAP1与肌球蛋白重链(MyHCⅠ、ⅡA、ⅡX)、MSTN、MyoG的表达关联性分析表明，YAP1与MyHCⅠ呈极显著负相关，与MyHCⅡ X、MSTN、MyoG呈极显著正相关，揭示YAP1与出生后肌纤维的发育有关联，可能参与了肌球蛋白重链基因的相互转化，并可能成为调节肌肉生长的候选基因。
　　3.重组质粒pEGFP-C1-YAP1经PCR、酶切、测序鉴定，证实YAP1基因CDS区已正确克隆入pEGFP-C1表达载体;经测序鉴定，YAP1第42位丝氨酸成功突变为丙氨酸。本研究为探索YAP1在成肌细胞增殖和分化过程中的调节机制奠定了实验基础。