桂苓消异方含药血清对子宫内膜异位症在位内膜基质细胞凋亡及NF-κB活性的影响

摘要

子宫内膜异位症是一种常见的良性妇科病变，其特征在于子宫内膜的腺上皮细胞和基质细胞存在于子宫腔以外的部位，临床上常见的部位有卵巢、输卵管、膀胱、子宫肌层等。它所引起的痛经、慢性盆腔痛和不孕等严重影响了中青年妇女的健康和生活质量，也日益受到人们的关注。因其发病机制未明，治疗的针对性不强，该病的诊治依然困扰着妇产科的专家学者们。
　　本实验通过体外分离培养人子宫内膜基质细胞来研究桂苓消异方治疗子宫内膜异位症的微观作用机理，通过制备药物血清了解桂苓消异方对体外培养的基质细胞形态、细胞早期凋亡及细胞NF-κB的活性的作用。由于已有证据表明桂苓消异方对体外培养的内异症患者的在位子宫内膜基质细胞上清液中表达的IL-8有抑制作用[1]，本实验以此为基础进一步研究IL-8的表达是否会受基质细胞NF-κB活性的影响，以探讨桂苓消异方含药血清能否通过降低NF-κB的活性来抑制IL-8的分泌，为临床上此方治疗子宫内膜异位症提供理论支持。
　　1、桂苓消异方治疗子宫内膜异位症的中医理论基础
　　中医学古籍中并未记载子宫内膜异位症病名，将其归于“痛经”、“不孕”、“癥瘕”、“月经不调”等范畴。目前多数学者认为此病的治疗应当从温肾化瘀着手，肾虚是发生本病的根本，血瘀是其重要的致病因素和病理表现。
　　桂苓消异方是导师在张仲景《金匮要略》中记载的桂枝茯苓丸基础上去蜂蜜，加仙灵脾、血竭粉而成。桂枝茯苓丸本来是用于治疗妊娠之后癥积害胎者，导师加用仙灵脾和血竭粉增强了原方温肾、祛瘀的力量，临床观察此方用于内异症的治疗效果显著。本课题用桂苓消异方含药血清对人子宫内膜异位症在位内膜细胞进行体外研究，为桂苓消异方的临床应用提供了理论依据。
　　2、分离纯化体外培养人子宫内膜基质细胞
　　收集2011年9月至2012年5月因子宫内膜异位症在扬州市第一人民医院妇产科采取手术治疗的患者的在位子宫内膜作为实验组，同时收集诊断为非内异症且开腹或腹腔镜术后病理提示为正常的内膜作为对照组，两组内膜术后病理提示分别为内异症和正常子宫内膜。对收集的内膜标本分离培养基质细胞，视细胞生长情况进行传代，并利用免疫组化法鉴定细胞纯度。根据经验，选取术前B超提示内膜厚度至少为5mm的患者作为采集对象。
　　结果显示，在现有的实验条件下并结合参考查阅文献，以胶原酶消化、筛网分离为主要实验方法，人子宫内膜基质细胞的分离培养及传代情况良好。实验观察基质细胞可传4-5代，传代后的细胞活性及生长情况未因传代受明显影响。通过实验后统计分析，发现在本实验条件下内异症与非内异症内膜均可分离培养成功，取材时内膜所处的月经周期对细胞的成活率无明显影响。成功分离培养出子宫内膜基质细胞为下一步的实验提供了良好的平台。
　　3、桂苓消异方对子宫内膜异位症在位内膜基质细胞早期凋亡的影响
　　制备桂苓消异方药物血清，同时设空白组和西药对照组，用药物血清干预内异症患者的在位子宫内膜基质细胞，观察药物影响下细胞的形态变化，并在检测细胞凋亡前收集24、48、72h三个时间段细胞培养的上清液，留待下一步检测;流式细胞仪技术检测不同血清浓度对子宫内膜异位症在位内膜基质细胞作用24、48、72h后细胞早期凋亡的影响。
　　4、子宫内膜异位症中NF-κB、IL-8的相关性探讨及桂苓消异方对内异症患者在位内膜基质细胞NF-κB活性的影响
　　用不同浓度的TNF-α，TNF-α+PDTC干预原代培养的人子宫内膜异位症在位内膜基质细胞，观察细胞形态的变化，并收集培养24h后的细胞培养上清液，通过ELISA法检测上清液中NF-κB活性、IL-8浓度，利用统计学方法分析两者之间的相关性。
　　ELISA法检测上一步实验中收集的药物血清作用后的内异症患者基质细胞上清液中的NF-κB活性。
　　通过ELISA定量检测表明，在经TNF-α，TNF-α+PDTC处理过的内异症基质细胞上清液中IL-8的表达与NF-κB的活性具有相关性，说明子宫内膜异位症中的IL-8的表达可能与NF-κB途径相关;同时检测的数据表明桂苓消异方含药血清能降低内异症患者在位子宫内膜基质细胞上清液中的NF-kB的活性。因前期研究已表明桂苓消异方可抑制子宫内膜基质细胞IL-8的表达，这提示桂苓消异方可能是通过NF-κB途径间接抑制IL-8的分泌，来控制子宫内膜异位症的发生和发展。