禽病原性大肠菌ompA、ompT基因和肠炎沙门氏菌ompA、pgtE基因突变株的构建及其生物学特性研究

摘要

禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenicEscherichia coli, APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病，且易与其它病原细菌、病毒并发或混合感染。目前，该病已成为危害养禽业的重要细菌病，给世界范围内养禽业造成了巨大的经济损失。
　　肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis，SE)是一类泛嗜性沙门氏菌，是人和动物的重要致病菌，它不仅能引起多种畜禽疾病，造成全身性感染、腹泻和胃肠炎等，而且是引起人类食物中毒的主要病原菌之一，主要污染蛋类和禽肉类食品，在兽医公共卫生学上具有重要意义。
　　OmpA(outer-membrane protein A)是革兰氏阴性细菌OMPs的主要蛋白，在维持外膜结构稳定、作为噬菌体TuⅡ受体等方面有重要的功能，同时也作为黏附素或侵袭素，与细菌的毒力相关。OmpT(outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌尤其是大肠杆菌的一种重要防御性分子，属于Omptin外膜蛋白家族，包括肠炎沙门氏菌的PgtE蛋白已被证明是重要的毒力因子。研究表明ompT基因编码外膜蛋白酶，ompA基因编码外膜蛋白A，在尿路感染和脑膜炎临床分离株中的检出率很高，是假定的致病性大肠杆菌的毒力相关因子。本研究旨在探讨ompA、ompT和pgtE基因与APEC和SE致病性之间的关系，了解APEC ompA、ompT与SE ompA、pgtE基因突变株的生物学特性，为揭示APEC和SE的致病机理及进一步构建APEC和SE弱毒疫苗株奠定基础。
　　本研究运用λ-Red同源重组的方法构建了E058△ompA、E058△ompT及CVCC3378△ompA、CVCC3378△pgtE基因缺失突变株，同时将带有相应启动子的缺失基因完整阅读框插入表达载体pGEX-6P-1中，通过电转化突变株来筛选获得回复株。PCR扩增带酶切位点的ompA基因并插入到pMD(R)18-T simple vector载体中，筛选出阳性重组子T-ompA，然后运用分子克隆方法将Zeocin抗性基因插入到目的基因ompA中，构建出带Zeocin抗性基因的质粒T-ompA-Zeo。PCR扩增出片段ompA-Zeo，并电转化入带有质粒pKD46的禽病原性大肠杆菌分离株E058中，运用同源重组的方法，筛选出基因突变株E058△ompA。运用相同的同源重组方法，依次筛选出基因突变株E058△ompT、CVCC3378△ompA、CVCC3378△pgtE。
　　RT-PCR结果表明各突变株基因的缺失只影响突变基因本身的表达，而其上下游基因的转录正常;生长曲线的测定结果显示，各突变株、回复株的生长速度与亲本株相似，并未表现出明显差异;SPF鸡血清杀菌试验、HD-11细胞吞噬试验、1日龄SPF鸡致死试验结果说明，与野生株E058和CVCC3378相比，突变株E058△ompA、E058△ompT、CVCC3378△ompA、CVCC3378△pgtE均表现出了轻微致弱;体内竞争及动态分布试验表明，与野生株相比，各突变株在各个被检脏器中数量均明显下降，差异显著，而回复株较相应的突变株毒力则有显著提高。