脂肪酶固定化及其在催化合成乙酸香茅酯中的应用研究

摘要

脂肪酶是在化工、制药、食品、能源等诸多领域具有广泛应用的一类酶，能够催化酯水解、酯合成、酯交换、多肽合成等反应，已成为工业用酶的研究热点。针对游离脂肪酶在有机溶剂中易聚集成团，催化效率较低，且稳定性差等问题，本文以脂肪酶催化转酯化反应合成乙酸香茅酯为对象，以制备高催化活性及高稳定性的固定化脂肪酶为目标，从固定化材料和固定化方法两个方面研究固定化条件对酶催化性能的影响以及固定化酶在不同工艺条件下对制备乙酸香茅酯的影响。 (1)以脂肪酶为研究对象，采用溶胶-凝胶包埋法进行脂肪酶的固定化。结果表明，脂肪酶经溶胶-凝胶包埋法固定化后其比活较游离酶相比有了明显的提高。最终确定固定化条件为:硅源为摩尔比1∶1的r-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(MAPTMS)和四甲氧基硅烷(TMOS)，给酶量为3mg/mL，水与硅源的摩尔数之比R值为20，水解时间为30min，缓冲液为pH值7.0、50mM的磷酸缓冲液，在此优化条件下，固定化酶的比活为游离酶的9.1倍。以香茅醇的转酯化反应为模型反应考察酶的稳定性。存放56天后，溶胶-凝胶包埋法固定化酶的活力残留为92％，游离酶的活力残留只有31％;重复使用7次后，活力残留仅有31％。 (2)以邻苯二胺为单体制备聚苯胺空心粒子和实心粒子载体，采用吸附法及共价结合法进行脂肪酶的固定化。结果表明，脂肪酶经聚邻苯二胺载体固定化后其比活较游离酶相比有了明显的提高。最终确定吸附固定化酶的条件:用空心聚邻苯二胺粒子做载体，酶与载体的比例为2∶5，缓冲液pH为7.0、50mM的磷酸缓冲液，吸附时间为4h。此条件下，固定化酶的比活为游离酶的4.9倍。在此基础上，载体通过戊二醛修饰后采用共价结合法固定化酶，固定化条件为空心聚邻苯二胺载体经2％的戊二醛处理后，在40℃、缓冲液pH为7.0的条件下反应2h，固定化酶的比活为游离酶的5.3倍。以香茅醇的酯化反应为模型反应考察酶的稳定性，室温存放56天后，共价结合法固定化酶的活力残留为60％;重复使用7次后，共价结合法固定化酶的活力残留为95％。 (3)以制备的固定化脂肪酶为研究对象，研究固定化酶在不同工艺条件下对催化合成乙酸香茅酯的影响。最终确定溶胶-凝胶包埋法固定化酶催化合成乙酸香茅酯的优化条件为:固定化酶的用量为0.1g/mL，反应温度为40℃，反应过程中摇床转速为200rpm;共价结合法固定化酶催化合成乙酸香茅酯的优化条件为:固定化酶的用量为0.1g/mL，反应温度为50℃，反应过程中摇床转速为200rpm。同时，实验结果表明，溶胶-凝胶包埋法和共价结合法固定化酶在改变底物浓度和产物浓度时，都未出现明显的抑制现象。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 脂肪酶及其特性

1．1．1 脂肪酶的简介

1．1．2 脂肪酶的催化机理

1．1．3 影响脂肪酶催化反应的因素

1．2 酶的固定化

1．2．1 酶固定化的定义

1．2．2 固定化酶的方法

1．2．3 固定化酶的载体

1．2．4 固定化酶的意义

1．3 脂肪酶固定化的研究进展

1．3．1 共价键结合法的研究进展

1．3．2 交联法的研究进展

1．3．3 吸附法的研究进展

1．3．4 包埋法的研究进展

1．4 固定化脂肪酶制备酯类化合物的应用

1．4．1 催化内酯合成反应

1．4．2 催化酯化反应

1．4．3 催化转酯反应

1．4．4 催化酯交换反应

1．5 乙酸香茅酯概述

1．6 本文的研究内容和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 仪器及试剂

2．1．1 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 载体的制备

2．2．2 溶胶-凝胶包埋法固定化酶

2．2．3 吸附法固定化脂肪酶

2．2．4 共价结合法固定化脂肪酶

2．2．5 固定化酶催化转酯化反应制备乙酸香茅酯

2．3 分析方法

2．3．1 蛋白质含量的测定

2．3．2 酶活力的测定

2．3．3 酶反应稳定性的测定

2．3．4 酶存储稳定性的测定

2．3．5 乙酸香茅酯产率测定

2．3．6 合成乙酸香茅酯反应初速度的测定

第三章 溶胶-凝胶包埋法固定化脂肪酶

3．1 不同硅源对固定化效果的影响

3．2 不同硅烷前体比例对固定化效果的影响

3．3 不同给酶量对固定化效果的影响

3．4 不同水添加量对固定化效果的影响

3．5 不同水解时间对固定化效果的影响

3．6 不同pH值对固定化效果的影响

3．7 固定化酶的反应稳定性

3．8 固定化酶的存储稳定性

3．9 本章小结

第四章 吸附法及共价结合法固定化脂肪酶

4．1 载体的表征

4．2 不同载体对固定化效果的影响

4．3 不同吸附时间对固定化效果的影响

4．4 不同给酶量对固定化效果的影响

4．5 不同pH值对固定化效果的影响

4．6 不同吸附温度对固定化效果的影响

4．7 共价结合法对固定化效果的影响

4．8 固定化酶的反应稳定性

4．9 固定化酶的存储稳定性

4．10 本章小结

第五章 固定化脂肪酶催化转酯化反应制备乙酸香茅酯

5．1 固定化酶的量对制备乙酸香茅酯的影响

5．2 反应温度对制备乙酸香茅酯的影响

5．3 反应转速对制备乙酸香茅酯的影响

5．4 底物浓度对制备乙酸香茅酯的影响

5．5 产物浓度对制备乙酸香茅酯的影响

5．6 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

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