全谷豆包植物活性成分及其改善HepG2细胞胰岛素抵抗作用与AMPK通路机制探讨

摘要

目的:(1)提取熟化前后全谷豆包中膳食纤维(DF）、类黄酮(FN)、酚酸(PAD)和植物固醇(PS)，测定其含量和体外抗氧化能力，了解全谷豆包中活性成分提取物产生生物学效应的物质基础;
　　(2)观察全谷豆包中活性成分提取物对棕榈酸(PA）诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗作用的影响，测定细胞对葡萄糖的消耗量与细胞中甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的含量，阐明不同种类活性成分提取物对HepG2细胞胰岛素抵抗作用的干预效果差异;
　　(3)观察全谷豆包中活性成分提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞中的腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPKα2)、乙酰辅酶A羟化酶(ACC1)、脂肪酸合成酶(FAS)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同激活因子-1(PGC-1)在mRNA水平上的影响，探讨全谷豆包中活性成分对胰岛素抵抗HepG2细胞的作用机制;
　　(4)比较熟化对全谷豆包中活性物质及其改善HepG2细胞胰岛素抵抗作用的影响效果。
　　方法:(1)用酶-化学法提取熟化前后全谷豆包中的膳食纤维，按国标法测定其含量;用浸提回流法提取熟化前后全谷豆包中的类黄酮，用超声波萃取法提取熟化前后全谷豆包中的酚酸和植物固醇，用比色法测定其含量。采用DPPH自由基清除法和T-AOC总抗氧化能力检测法测定不同活性成分提取物的体外抗氧化能力;
　　(2)用棕榈酸诱导HepG2细胞建立体外胰岛素抵抗模型，通过MTT、油红O染色、葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的消耗量以及细胞中TG的含量，判定胰岛素抵抗细胞模型建立成功，确定棕榈酸最佳浓度;
　　(3)棕榈酸诱导HepG2细胞胰岛素抵抗模型后，加入不同活性成分提取物，测定细胞对葡萄糖的消耗量与细胞中TG的含量和抗氧化指标MDA、SOD、GSH-PX的含量，半定量PCR测定AMPKα2、ACC1、GLUT2、FAS、PGC-1的基因表达。
　　结果:(1)熟化前全谷豆包中膳食纤维的含量为17.5g/100g，类黄酮的含量为2.28g/100g，酚酸的含量为0.62g/100g，植物固醇的含量为4.60g/100g，熟化后全谷豆包中膳食纤维的含量为21.6g/100g，类黄酮的含量为3.51g/100g，酚酸的含量为0.52g/100g，植物固醇的含量为5.88g/100g;熟化前后全谷豆包中不同活性成分均具有很强的清除DPPH自由基能力和总抗氧化能力;
　　(2)0.25mM的棕榈酸对细胞活性无显著影响，且细胞对葡萄糖的消耗量显著降低，细胞内TG显著升高，细胞内脂滴蓄积明显，是诱导HepG2细胞形成胰岛素抵抗的最佳浓度;
　　(3) MTT实验中观察到，适当浓度(200μg/mL)的不同活性成分提取物对PA诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞有一定的保护作用。与类黄酮组、植物固醇组和膳食纤维组相比，酚酸组的保护作用较弱。油红O染色结果也显示，PA可造成细胞内游离脂肪酸升高，而不同活性成分提取物处理后，可减少细胞内游离脂肪酸的形成。200μg/mL熟化前后全谷豆包中活性成分提取物提高了细胞对葡萄糖的摄取能力，与阴性对照组差异无统计学意义(P＞0.05），均明显低于PA模型组(P＜0.05)。与PA模型组相比，降低了细胞中TG、MDA含量，升高了SOD、GSH-PX含量(P＜0.05），表明熟化前后全谷豆包中活性成分对胰岛素抵抗均具有一定的改善作用;
　　(4)与模型组相比，类黄酮组、酚酸组、植物固醇组和膳食纤维组细胞内AMPKα2、GLUT2和PGC-1 mRNA表达显著增高，且ACC1和FAS mRNA表达显著降低(P＜0.05)。除酚酸组外，其余组的基因表达改善效果与阴性对照组差异无统计学意义(P＞0.05）。
　　结论:(1)全谷豆包中富含膳食纤维、类黄酮、酚酸和植物固醇等抗氧化物质。这些活性成分具有很强的体外抗氧化能力;
　　(2)0.25mM的棕榈酸与HepG2细胞孵育24小时，能使细胞对葡萄糖的消耗量显著降低，形成胰岛素抵抗细胞模型;
　　(3)熟化前后全谷豆包中活性成分可以提高HepG2细胞内AMPKα2、GLUT2和PGC-1 mRNA的表达，降低ACC1和FAS mRNA的表达，从而改善PA诱导的胰岛素抵抗状态。这可能是全谷豆包改善机体胰岛素抵抗的机制之一;
　　(4)比较后发现，对HepG2细胞胰岛素抵抗状态的改善作用，类黄酮组效果最好，膳食纤维组和植物固醇组次之，而酚酸组效果不够明显，尤其是熟化后的酚酸组。可能原因是，酚酸是一类热不稳定物质，加热熟化会加速酚酸类物质的氧化分解。