miR--16在M2型巨噬细胞选择性激活中的作用研究

摘要

目的: 我们课题组前期研究应用microRNA芯片技术筛选出肝癌组织差异表达microRNAs，发现miR-16在肝癌组织中表达下调。初步预实验发现miR-16在单核细胞中高表达，而在体外诱导的M2型巨噬细胞中miR-16表达下调，提示miR-16的下调可能与巨噬细胞向M2型分化有关。本项目进一步探索miR-16对M2型巨噬细胞分化的调控作用，明确调节miR-16表达水平升高对巨噬细胞表型和功能分化的影响。本研究将揭示调控巨噬细胞分化的关键microRNA分子，为阻断巨噬细胞向M2型激活提供潜在干预靶点，也为调节抗肿瘤免疫提供新的思路。 方法: 1.为了明确miR-16在M2型巨噬细胞分化过程中的表达变化，将45ng/ml的IL-4加入人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1)，使其分化为M2型巨噬细胞，用ELISA法检测巨噬细胞诱导前后IL-10的分泌情况，用Real-time PCR法检测巨噬细胞诱导前后miR-16的表达情况。 2.建立miR-16过表达细胞株:首先构建miR-16过表达慢病毒载体;其次选用THP-1细胞系，将其体外诱导成M2型巨噬细胞，加入辅助感染试剂polybreen以及LV-hsa-mir-16-1病毒，培养48小时以后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，加入嘌呤霉素(Puromycin)筛选，以提高感染效率。感染3-4天后，观察荧光表达情况。感染5天后，进行下游实验;用流式细胞术、Real-time PCR法等分别检测感染效率，评价miR-16的过表达情况。 3.为了明确调节miR-16表达水平升高对巨噬细胞表型和功能分化的影响:用PI染色检测过表达miR-16对M2型巨噬细胞细胞周期的影响;用ELISA法检测M2型巨噬细胞miR-16过表达组和对照组上清液中IL-10的分泌情况;用流式细胞术检测过表达组和对照组胞内IL-10的表达情况;用Western blot法检测过表达组和对照组精氨酸蛋白酶-1（arginase-1，Arg1）的表达情况。 结果: 1.THP-1细胞系经IL-4诱导后，上清中IL-10的分泌逐渐增加，诱导至6-7d达峰值，提示M2型巨噬细胞体外诱导成功。检测诱导前后miR-16的相对表达水平发现:IL-4激活单核细胞为M2型巨噬细胞后，miR-16表达下调。 2.M2型巨噬细胞经慢病毒感染，嘌呤霉素筛选后，流式细胞仪检测GFP表达率提高至97.7％。统计学结果显示:过表达组中miR-16基因的表达水平可以达到阴性对照组的7.644±0.110倍(P＜0.05)。 3.M2型巨噬细胞经慢病毒感染过表达miR-16后，对照组在G1/G0期细胞的比例为54.67％，而过表达组在G1/G0比例则增至62.25％;过表达组在S期细胞的比例为36.31％，低于对照组在S期细胞的比例(42.12％)，提示:miR-16引起细胞周期G1期阻滞(P值＜0.05)。 4.ELISA法检测M2型巨噬细胞miR-16过表达组上清液中IL-10的分泌量为72.15±0.158pg/ml，较对照组（103.47±0.136pg/ml）低(P＜0.05)。流式细胞术检测M2型巨噬细胞过表达组和对照组IL-10胞内染色差异显示:过表达组IL-10的平均荧光强度Gm为3.47，胞内IL-10的表达水平较对照组(Gm=12.40)低(P＜0.05)。Western blot法检测M2型巨噬细胞精氨酸蛋白酶-1（arginase-1，Arg1）的表达情况，各组Arg1表达相对值即Arg1/β-actin的灰度值比值分别为:阴性对照组0.4565±3.14％，过表达组0.1158±2.83％。阴性对照和过表达组之间Arg1表达相对值的差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论: IL-4激活单核细胞为M2型巨噬细胞后，miR-16表达下调。通过慢病毒感染，过表达miR-16后，M2型巨噬细胞细胞周期G1期阻滞，上清和胞内IL-10的分泌均下调，Arg1蛋白表达水平同时下调，提示miR-16影响M2型巨噬细胞的表型和功能，对M2型巨噬细胞产生了一定程度的重塑作用。

目录

摘要

符号说明

前言

1．巨噬细胞

2．肿瘤相关巨噬细胞

3．miR-16

4．课题思路

材料与试剂

1．实验细胞

2．实验试剂

3．实验仪器

方法与步骤

1．细胞系的培养

2．慢病毒感染

3．荧光定量PCR检测miR-16的基因表达水平

4．PI染色检测细胞周期

5．ELISA法检测上清液IL-10的分泌水平

6．流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测胞内IL-10的表达水平

7．蛋白印迹法(Western Blot，WB)检测Arg1蛋白表达水平

8．统计分析

结果

1．M2型巨噬细胞的体外诱导

2．miR-16过表达细胞株的建立

3．miR-16对M2型巨噬细胞表型和功能分化的影响

讨论

1．体外诱导M2型巨噬细胞模型

2．慢病毒感染的优点

3．IL-10

4．Arg1

5．miR-16

结论

参考文献

综述 MicroRNAs对巨噬细胞极化性和可塑性的影响

致谢

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