鸡β2--微球蛋白在马立克氏病毒感染与致肿瘤中的作用研究

摘要

β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2m)由Berggard于1968年首次从肾小管病变患者的蛋白尿中分离出来，是一种非糖基化小分子蛋白，所有有核细胞均可合成。研究证实，β2m作为主要相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC)类分子的恒定链（轻链），对MHC-Ⅰ类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。β2m的功能研究发现，在人类一些肿瘤中，β2m与肿瘤的生存、侵袭、凋亡，甚至转移有关。虽然β2m为肿瘤治疗靶位以及致肿瘤机制的深入研究提供了新的途径，但β2m在肿瘤中的生物学功能目前仍不十分清楚。 马立克氏病(Marek's Disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek's Disease virus，MDV)引起的一种鸡的高度接触、传染性的恶性淋巴肿瘤性疾病。MDV是世界上第1个能用疫苗免疫预防的肿瘤疾病。正常细胞和癌细胞表达的β2m蛋白以及在临床上的应用已成为近年来人们研究的热点。本实验室在前期蛋白质组学研究中发现，在MDV感染鸡皮肤和法氏囊中鸡β2-微球蛋白(chickenβ2-microglobulin，chβ2m)异常表达的现象。然而chβ2m研究相对较少，并且对chβ2m在肿瘤与致病中的作用目前没有报道，因此，对chβ2m在MDV感染过程中作用研究，不仅可为全面了解MDV的致病机制，有效控制MD发挥重要作用，重要的是可为人类癌症新的治疗靶位发现提供借鉴，有十分重要的理论意义。 1.鸡β2-微球蛋白的克隆与原核表达 本研究通过RT-PCR从正常免疫鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m基因全长片段，然后将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG对其进行诱导表达，利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示，采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp，编码120个氨基酸，与已登录的chβ2m序列(GenBank: M84767.1，AY989898，Z48921)相一致，同源性为100％;然后将其克隆入pET-32a(+)，经0.8 mM IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清;利用His标签纯化该蛋白，SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带;western blot分析表明，纯化后的chβ2m融合蛋白可与抗His单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)发生反应。以上结果证实，本研究成功克隆chβ2m基因并获得原核表达载体pET-32a-chβ2m，利用该表达系统能够纯化得到大量可溶性chβ2m融合蛋白，可为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。 2.鸡β2-微球蛋白优势多肽序列的选择与单克隆抗体的制备 本研究对chβ2m与人、小鼠等其他种类β2m序列比较及抗原性分析后，选取chβ2m羧基端29个氨基酸序列合成多肽(NH2-TPSSGSTYACKVEHETLKEPQVYKWDPEF-COOH)免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术筛选抗chβ2mmAb并对其特性进行鉴定。结果筛选出五株抗chβ2mmAb，IgG亚类鉴定1E2，2E9，7D5为IgM型，3D1与6E7属于IgG1/κ型;Western blot和间接免疫荧光分析发现，抗体6E7与3D1同人和小鼠β2m无交叉反应性，仅能识别转染pcDNA3.1-chβ2m的293T细胞和HD11细胞中的chβ2m抗原;血清Western blot显示，抗体3D1可识别鸡血清和血浆中的chβ2m，而与牛和鸭血清无任何反应;流式细胞术表明3D1可以与MSB1细胞中天然的chβ2m反应;另外，通过免疫组化分析发现，在胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官均能表达chβ2m，但不同区域细胞的表达水平具有差异性。以上结果均证实，本研究成功筛选出抗chβ2m单克隆抗体，其具有良好的特异性，适用于多种免疫化学技术，可为进一步探索β2m在免疫学与致病过程中的功能研究提供有力的工具。 3.稳定表达鸡β2-微球蛋白293T细胞的筛选与鉴定 本研究将重组真核表达质粒pcDNA3.1-chβ2m通过脂质体转染人胚肾上皮细胞系293T后，利用zeocin筛选能稳定表达chβ2m的细胞系293T-chβ2m，并对其表达情况进行鉴定。结果显示，质粒转染72 h后，加入药物zeocin(500μg/ml)筛选4周后获得药物抗性细胞;Western-blot鉴定发现chβ2m不仅可在抗性细胞中高效表达，其上清中也可检测到分泌的chβ2m;间接免疫荧光表明，抗chβ2m抗体能够检测到抗性细胞内chβ2m，呈强荧光反应;应用免疫共沉淀方法筛选能够与chβ2m在293T细胞中结合的免疫相关蛋白，未发现chβ2m与人MHC-Ⅰ结合的现象。以上结果证实，本研究成功筛选出能稳定表达chβ2m的细胞系293T-chβ2m，不仅可为获取真核表达的chβ2m提供材料，也可为β2m可能的相互作用蛋白研究提供借鉴。 4.鸡β2-微球蛋白及其MHC-Ⅰ在马立克氏病毒感染不同细胞中的基因表达 本研究以MDV meq作为MDV感染标示分子，应用荧光定量PCR技术对chβ2m、MHC-Ⅰ和Meq在MDV感染不同细胞中基因表达水平进行检测。结果显示，在BUdR刺激下，MDV淋巴癌细胞系MSB1中Meq基因表达水平随着培养时间不断上调(48 h，P＜0.01)，chβ2m基因表达水平于培养后24 h上调显著(P＜0.01)，48 h虽然上调，但上调不显著(P＞0.05)，而MHC-Ⅰ随着培养时间显著下调，特别是48 h后MHC-Ⅰ下调显著(P＜0.01);通过GA株感染CEF后发现，Meq基因表达水平在MDV感染的CEF细胞中逐渐上调，于感染后120 h(hours post-infection)达到最高峰，MHC-Ⅰ在MDV感染CEF前期24 hpi较对照组明显升高(P＜0.05)，在120 hpi显著低于对照组(P＜0.05)，而chβ2m在前期显著上调，于24 hpi和120hpi(P＜0.01)上调显著;另外，我们调查了MDV RB1B株感染鸡外周血淋巴细胞内表达情况，发现Meq基因表达水平于感染后第7天(dpi)开始表达，28 dpi达到高峰，chβ2m与MHC-Ⅰ在感染前期显著上调(4 dpi，P＜0.01)，只有在MDV感染潜伏期(14 dpi，28 dpi)，MHC-Ⅰ与chβ2m同对照组相比明显下调(P＜0.01)，感兴趣的是于35 dpi后chβ2m与MHC-Ⅰ又恢复上调趋势。研究结果表明，chβ2m与MHC-Ⅰ在MDV感染不同细胞中呈波动式变化，与MHC-Ⅰ相比，chβ2m在感染前期出现异常表达上调，这提示chβ2m在MDV感染过程中具有潜在的功能。另外，我们发现chβ2m与MHC-Ⅰ表达不一致的现象，其机理有待于进一步研究。 5.抗鸡β2-微球蛋白单克隆抗体对MSB1细胞的作用及机制 本研究在正常培养的MSB1细胞中加入不同浓度chβ2m抗体后利用CCK-8法检测细胞生长活力，然后通过AnnexinⅤ/PI流式细胞术、DNA ladder和DAPI核染色观察chβ2m抗体对MSB1细胞的凋亡情况，并利用Real-time PCR检测凋亡相关信号分子caspase-3、8、9的表达。结果显示，加入20、40、60、80μg/mL chβ2m抗体后，60μg/mL(P＜0.05)和80μg/mL(P＜0.01) chβ2m抗体共培养的MSB1细胞生长活力显著低于同浓度IgG对照组和正常培养细胞空白组，且随着培养时间的增加chβ2m抗体(80μg/mL)对MSB1细胞生长抑制活力显著增加;流式细胞术分析发现，于48 h后chβ2m抗体(80μg/mL)可明显引起MSB1细胞的凋亡，AnnexinⅤ+阳性细胞可达51.7％; DNA ladder和DAPI核染色观察发现，chβ2m抗体(80μg/mL)与MSB1细胞作用48 h后，可见典型的凋亡中后期细胞基因组断裂形成的梯带和DAPI核染出现的核浓缩、不规则等明显的凋亡特征;Real-time PCR检测caspase-3、8、9等信号分子表达显示，在加入chβ2m抗体后caspase-9和caspase-3较IgG对照组表达明显上调(P＜0.01)，而caspase-8在基因水平上无明显的差异。以上结果表明，利用抗体阻断chβ2m后可通过caspase-9和caspase-3的高表达引起MDV肿瘤细胞MSB1的凋亡。 6.鸡胚成纤维细胞过表达鸡β2-微球蛋白对MDV感染复制的影响 在前期研究中发现，chβ2m在MDV感染不同体内外细胞中异常表达的现象。为初步探索鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts，CEF)过表达chβ2m对MDV感染复制的影响。本研究通过MDV感染CEF细胞后利用脂质体转染的方法将不同浓度pcDNA3.1-chβ2m(4μg，0.4μg)与pcDNA3.1对照质粒(4μg)分别转染CEF细胞，于转染后不同时间点应用Real-time PCR检测不同转染组细胞内gB、meq以及chβ2m的基因表达水平。结果显示，在转染4μg pcDNA3.1-chβ2m的CEF感染组中，chβ2m随着培养时间的延长表达水平不断升高，于培养后72 h较pcDNA3.1-chβ2m0.4μg转染组和pcDNA3.1空载体转染组上调极显著(P＜0.01);随着chβ2m在细胞内表达的提高，MDVgB与meq基因表达水平较低浓度转染组(0.4μg)和空质粒转染对照组都明显提高(72 h，gB P＜0.01;Meq，P＜0.05)，而chβ2m、gB与meq mRNA水平在低浓度转染组与转染对照组之间无显著差异。以上结果表明，MDV在体外过表达chβ2m CEF细胞中其感染复制能力相应上调，可为chβ2m在MDV-宿主相互作用关系中的作用研究提供理论价值。

目录

摘要

中英对照缩略词

第一部分 文献综述

综述一 马立克氏病毒及其肿瘤模型的研究进展

综述二 β2-微球蛋白作为癌症治疗靶分子的研究进展

第二部分 研究内容

第一章 鸡β2-微球蛋白的克隆与原核表达

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第二章 鸡β2-微球蛋白优势多肽序列的选择与单克隆抗体的制备

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第三章 稳定表达鸡β2-微球蛋白293T细胞的筛选与鉴定

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第四章 鸡β2-微球蛋白及其MHC-I在马立克氏病毒感染不同细胞中基因表达水平检测

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第五章 抗鸡β2-微球蛋白单克隆抗体可诱导MSB1细胞凋亡

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第六章 鸡胚成纤维细胞过表达鸡β2-微球蛋白对马立克氏病毒感染复制的影响

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

全文总结

参考文献

致谢

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