透明质酸修饰/共载金丝桃素和乏氧诱导因子1α--siRNA的双靶向纳米粒的制备及评价

摘要

本研究拟构建共载针对乏氧诱导因子1α(HIF1α)的siRNA及具有坏死组织亲和性的金丝桃素的PLGA-PEI纳米粒，并进行透明质酸(HA)修饰，研究其理化性质的同时评价该载体对肿瘤的体内外靶向性，以期研制出一种高效、低毒、稳定的靶向放疗增敏药物。 第一部分乏氧细胞模型制作及针对乏氧诱导因子1α(HIF-1α)的siRNA的构建和筛选:利用western blot方法检测出最佳的使鼻咽癌细胞CNE2乏氧的二氯化钴浓度，以模拟乏氧细胞的状态，为接下来的实验创造最佳条件。western blot结果显示细胞内加入150μ mol/l的二氧化钴对鼻咽癌细胞CNE2的HIF-1α表达抑制效果最佳。同时，设计针对乏氧诱导因子1α(HIF1α)表达的6对(siRNA1217，siRNA1612，siRNA2258，siRNA2752，siRNA3724，siRNA3168)及一条阴性对照siRNA(称为NC)。在Lipofectamine2000介导下转染人鼻咽癌细胞系CNE2。同时采用RT-PCR法和Western blot方法检测细胞中HIF-1α含量，以β-actin蛋白做内参照。结果显示:当2μL的Lipofectamin2000(40pmol/L)转染细胞时，能达到最佳转染效率。与其他各组相比，转染了siRNA3724，siRNA3168基因序列的人鼻咽癌细胞中，编码H IF-1αmRNA的含量明显减少。成功设计了针对HIF-1α的siRNA，并从中筛选出siRNA1612，siRNA3724，siRNA3168都能够有效抑制人鼻咽癌表达。 第二部分载金丝桃素的PLGA-PEI纳米粒的构建、修饰、毒性及稳定性评价:利用乳化溶剂挥发法制备载金丝桃素的PLGA-PEI纳米粒，然后对其表面进行不同比例的透明质酸修饰，从而使之在水中能形成粒样结构，最终制备并评价得出稳定性最高的疏水改性阳离子型透明质酸修饰纳米粒。其次，采用透射电镜和原子力显微镜考察纳米粒的外观，均显示为类圆形，大小200nm左右，zeta电位为±20mv，均符合相关纳米粒要求。HA的投药量对载金丝桃素的PLGA-PEI纳米粒的考察结果显示当N/COOH大于等于4开始，纳米粒的粒径和电位都发生较大的变化，考虑是由于加入的HA本身带有负电荷的作用。再者，MTT实验结果示HA-PLGA-PEI-Hypericin NPs则比PLGA-PEI-HypericinNPs有较小的细胞毒性，这让我们更加相信透明质酸在不影响纳米粒理化性质的同时还可以降低阳离子脂质体的细胞毒性;利用琼脂糖凝胶电泳的方法证明了不论是经过HA修饰的或是未经HA修饰的样品都可以与呈阴离子的siRNA形成更牢固的结合;肝素解离实验和抗核酸酶实验证明了所制备出的纳米粒载体具有较好的保护RNA能力，使得RNA免受RNAase的降解，有利于siRNA在体内的稳定。最后本课题利用细胞转染这一技术，考察4种不同物质在人胃癌细胞SGC7901中的转染效率，结果HA修饰的PLGA-PEI纳米粒转染率与市售脂质体转染试剂未经HA修饰的纳米粒存在显著性差异。这主要是由于癌细胞的表面高表达的CD44，这就增强了HA修饰的PLGA-PEI纳米粒中的亲水外壳HA与CD44分子的靶向性结合，从而增加了细胞摄取率。 第三部分靶向性评价:首先研究了siRNA胞内转染效果，使用激光共聚焦显微镜，对PLGA-PEI NPs/Cy3-siRNA复合物在SGC7901进行胞内转染6h，通过胞内断层扫描图像与三维重建图像确证该递送系统可有效将siRNA递送至SGC7901内。通过断层扫描证明PLGA-PEI NPs/Cy3-siRNA能被SGC7901细胞摄取，且有Cy3-siRNA进入细胞核内，其机理还有待进一步研究。其次，主要在定性和定量方面考察研究了载金丝桃素的PLGA-PEI细胞摄取结果。结果显示其进入细胞核的比例与金丝桃素浓度呈正相关，即浓度越大入核量越多。另外，经过HA修饰的载金丝桃素PLGA-PEI纳米粒的细胞摄取量最大，考虑为HA与细胞表面CD44的亲和性增加了纳米粒与载体结合的能力，进而进入细胞内发挥作用。流式细胞仪测定结果与该结果相符。接着，利用受体抑制实验有效证明了HA可以提高PLGA-PEI纳米载体的靶向性，提高其所载基因及小分子药物金丝桃素进入细胞核内的效果。最后，在体靶向性实验证明单纯金丝桃素制剂具有一定的肿瘤靶向性，而PLGA-PEI-Hypericin NPs及HA-PLGA-PEI-Hypericin NPs则提高了金丝桃素的肿瘤摄取率。其中HA组显示了较强的荧光。证明了HA可以提高金丝桃素的肿瘤靶向性。HE组织切片证明了坏死范围较大（图中表现为组织疏松，无细胞核）的组织金丝桃素含量增多，证明了瘤体的坏死程度与金丝桃素的摄取量呈正相关。为金丝桃素纳米粒的体内靶向性验证提供了方法学基础。

目录

摘要

符号说明

第一章：前言

第二章：乏氧模型建立及HIF-1α-siRNA有效干扰序列筛选

一．仪器与试药

1．1 仪器

1．2 主要试药

二．实验方法

2．1 乏氧细胞模型的构建

2．2 有效干扰HIF-1α的siRNA序列筛选

2．3 统计学分析

三．结果与讨论

3．1 乏氧细胞模型的制作

3．2 HIF-1α-siRNA有效干扰序列筛选

四．小结

第三章 透明质酸修饰载金丝桃素纳米粒的制备及评价

一．仪器与试药

1．1 仪器

1．2 试药

二．实验方法

2．1 纳米粒的制备

2．2 纳米粒的外观考察

2．3 纳米粒的形态学考察

2．4 纳米粒的粒径和电位测定及透明质酸投药量的影响

2．5 纳米粒的电泳考察

2．6 细胞毒性试验

2．7 透明质酸对纳米粒转染效率的影响

三．结果与讨论

3．1 三种纳米粒的外观考察

3．2 纳米粒的显微形态学表征结果

3．3 纳米粒的粒径、电位图

3．4 透明质酸投药量对纳米粒粒径、电位的影响

3．5 电泳考察结果

3．6 MTT结果

3．7 透明质酸对纳米粒转染效率的影响

四．本章小结

第四章：载金丝桃素纳米粒的体外靶向性考察及其体内坏死亲和性初探

一．仪器与试药

1．1 仪器

1．2 试药与材料

二．实验方法

2．1 细胞的复苏与培养

2．2 细胞的传代培养

2．3 激光共聚焦显微镜观察siRNA胞内转染效果

2．4 细胞转染考察

2．5 细胞摄取考察

2．6 受体抑制实验

2．7 在体靶向性考察

三．结果与讨论

3．1 激光共聚焦显微镜观察siRNA胞内转染效果

3．2 PLGA-PEI纳米粒及HA-PLGA-PEI纳米粒的细胞转染结果

3．3 载金丝桃素的PLGA-PEI细胞摄取结果

3．4 受体抑制实验

3．5 体内靶向性考察

四．本章小结

第五章：结论与展望

参考文献

致谢

作者在读期间所发表及待发表论文情况

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