表达鸡白细胞介素2的重组马立克病毒的免疫保护效力及免疫增强作用

摘要

疫苗的使用在马立克氏病(MD)的预防和控制中起到重要作用。但随着马立克氏病毒(MDV)毒力不断的进化，现有疫苗已不能提供较好的保护。鸡白细胞介素2（ChIL-2）是具有广泛生物活性的细胞因子，作为免疫增强剂在疫苗的研制中得到广泛研究。本研究利用MDV血清Ⅰ型毒株CVI988/Rispens为载体，构建表达ChIL-2基因的重组病毒(rMDV-IL2)，评价其免疫保护效力及免疫增强作用，为MD及其他疾病的防制提供疫苗储备。 将ChIL-2基因定向克隆至pEASY-M1表达载体中，通过PCR方法扩增出ChIL-2基因的表达盒，并与实验室先前构建的含有CVI988/Rispens基因组同源臂的pU/D载体相连，构建转移载体pU/IL2/D。将pU/IL2/D与含有GFP报告基因的CVI988/Rispens基因组共转染CEF细胞，通过筛选、纯化获得重组病毒rMDV-IL2。PCR、Western-Blot和MTT试验及复制特性检测结果显示，ChIL-2基因正确插入到MDV基因组中并能成功表达具有生物活性的ChIL-2，且对病毒在体外的复制特性无显著影响。 对1日龄雏鸡分别免疫rMDV-IL2和CVI988/Rispens后的免疫器官指数进行测定，结果显示rMDV-IL2组的免疫器官指数均高于CVI988/Rispens组，免疫后21d和28 d胸腺指数存在显著性差异;免疫后21 d、28 d和35 d脾脏指数和法氏囊指数均存在显著性差异。在外周血T淋巴细胞亚群检测试验中，rMDV-IL2组与CVI988/Rispens组的CD4+T淋巴细胞变化规律类似，但前者要高于后者，其中21 d和28 d存在显著性差异;rMDV-IL2组CD8+T淋巴细胞在免疫后第7d就显著高于CVI988/Rispens组，第28 d达到最高值并维持在较高水平。这表明rMDV-IL2能促进免疫系统发育和成熟，提高细胞免疫应答水平。 在对rMDV-IL2的免疫保护效力测定试验中，对1日龄雏鸡分别免疫rMDV-IL2和CVI988/Rispens，7日龄用1000 PFU的MDV RB1B株进行攻毒，连续观察90天。通过体重称量、淋巴细胞转化水平检测、免疫器官指数测定以及保护指数计算等方法来评价rMDV-IL2的免疫保护效果。结果显示，rMDV-IL2能有效地控制强毒攻击后引起的体重下降，且淋巴细胞转化水平显著高于CVI988/Rispens组。免疫器官指数测定结果显示，rMDV-IL2组高于CVI988/Rispens组。胸腺指数在攻毒后28d差异显著(p＜0.05);脾脏指数和法氏囊指数在攻毒后21d、28d和35d差异显著(p＜0.05)。rMDV-IL2组的PI为81.6％，CVI988/Rispens组的PI为78.9％。 为了验证rMDV-IL2表达的ChIL-2对其他疫苗是否具有免疫增强作用，将rMDV-IL2和CVI988/Rispens分别免疫1日龄雏鸡，10日龄免疫新城疫La Sota疫苗，每周进行NDV抗体检测，持续三周。NDV抗体的HI试验和ELISA检测结果显示，rMDV-IL2组在免疫后一周，抗体滴度大于4log2，免疫后3周内抗体水平持续升高，且抗体滴度在前两周内显著高于CVI988/Rispens组和对照组。这说明rMDV-IL2能促进新城疫La Sota疫苗免疫后抗体的生成，具有免疫增强作用。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 马立克氏病疫苗的研究进展

1．1 MDV的发现和分型

1．2 MDV毒力的进化

1．3 MD疫苗的免疫保护机制

1．4 MD疫苗

2 鸡白细胞介素-2(ChIL-2)的研究进展

2．1 ChIL-2的免疫增强作用

2．2 ChIL-2的免疫治疗作用

第二章 表达鸡白细胞介素2的重组马立克病毒的免疫保护效力及免疫增强作用

1 材料

1．1 质粒、细菌、病毒和细胞

1．2 鸡胚和实验动物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 转移载体的构建

2．2 重组病毒的构建

2．3 rMDV-IL2对鸡免疫系统的影响

2．4 rMDV-IL2的免疫效力试验

2．5 rMDV-IL2对新城疫La Sota疫苗的免疫增强作用

2．6 统计分析

3 结果

3．1 转移载体的构建

3．2 重组病毒的挑选与纯化

3．3 rMDV-IL2的鉴定

3．4 rMDV-IL2对鸡外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞比例的影响

3．5 rMDV-IL2免疫后对鸡免疫器官指数的影响

3．6 MDV超强毒株RBIB感染鸡后的病理学观察

3．7 rMDV-IL2的免疫保护效力

3．8 rMDV-IL2对新城疫La Sota疫苗免疫后抗体滴度的影响

4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

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