沙门菌多重PCR检测方法的建立及鸡白痢沙门菌aroA缺失株的构建

摘要

沙门菌是一种兼性胞内致病菌，能够引起系统或局部感染。宿主感染后既可引起胃肠炎、流产、败血症等症状，又可表现为带菌不发病的状态。随着抗菌药物在临床和动物饲料中的广泛使用，沙门菌耐药性日趋严重，在多种动物中的感染率亦逐渐上升，引起了巨大的经济损失。沙门菌的鉴定主要是通过细菌分离、血清型鉴定、生化鉴定等传统方法，但是传统方法费时费力，有些血清型难以区分。因此，迫切需要一种能够快速检测沙门菌的方法，并且采取有效的防制措施来降低家禽的感染率，提高家禽及其产品的质量。 本研究根据沙门菌属特异性基因（hut）及肠炎沙门菌（SdfⅠ），鼠伤寒沙门菌（Spy），鸡白痢沙门菌(glgC)，鸡伤寒沙门菌(glgC和speC)的血清型特异性基因分别设计一对引物，建立了mPCR方法，可同时检测鉴定出肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及鸡伤寒沙门菌。选取由mPCR方法鉴定出的鸡白痢沙门菌S004、S005、S017及实验室保存菌S6702株，利用λRed同源重组技术，成功构建了鸡白痢沙门菌aroA缺失株:S004△aroA、S005△aroA、S017△aroA和S6702△aroA，并对其生物学特性及毒力进行了测定，为沙门菌减毒活疫苗的研制奠定了基础。 1快速检测肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌mPCR方法的建立 根据沙门菌属特异性基因（hut、495 bp）及肠炎沙门菌（SdfⅠ、304 bp）、鼠伤寒沙门菌（Spy、401bp）、鸡白痢沙门菌(glgC、252bp)和鸡伤寒沙门菌(glgC、252bp和speC、174bp)的血清型特异性基因分别设计引物，调节模板用量，dNTP、Taq酶的比例和退火温度，建立mPCR方法。菌液PCR敏感度结果显示:肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的最低检出量均为3×103 CFU;提取沙门菌DNA的敏感度结果显示:鉴别肠炎、鼠伤寒、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌的最低检量分别为162 pg/μL、202 pg/μL、214 pg/μL和178 pg/μL。与常规的分离鉴定相比，所建立的mPCR检测沙门菌属和鼠伤寒沙门菌的敏感性、特异性、符合率均为100％;检测肠炎沙门菌的敏感性、特异性、符合率分别为100％、98％、98.2％;检测鸡白痢沙门菌的敏感性、特异性、符合率分别为100％、94.6％、96.4％。不在其中的血清型也可以通过属特异性基因hut基因的扩增检测出，因此不会漏检临床样品中的沙门菌。 2鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性的初步研究 根据GenBank提供的基因序列扩增鸡白痢沙门菌临床分离菌株的aroA基因。利用λRed同源重组技术，构建鸡白痢沙门菌aroA缺失株:S004△aroA、S005△aroA、S017△aroA和S6702△aroA。通过PCR鉴定，缺失株构建成功。 4株野生株及其缺失株的生长曲线显示，野生株中S6702生长速度最快，其它3株鸡白痢沙门菌生长速度相似;与野生株相比，缺失株的生长速度均有所下降，缺失株中S6702△aroA生长速度最快。用不同剂量的野生株与缺失株分别通过肌肉接种2日龄SPF雏鸡，测定其半数致死量(LD50)，结果显示，野生株S004、S005、S017和S6702的LD50分别为106.30、107.040、106.612和108.34，而缺失株S004△aroA、S005△aroA、S017△aroA和S6702△aroA的LD50分别为108.60、108.256、108.190和108.57。可以看出，S004缺失株毒力显著降低，S6702缺失株毒力降低最少，但是其野生株毒力较其他野生株毒力也较弱。因此，aroA的缺失对鸡白痢沙门菌的致弱作用与菌株有关。鸡白痢沙门菌aroA致弱株的构建为疫苗候选株的筛选奠定了基础。

目录

摘要

符号说明

综述 禽沙门菌疫苗的研究进展

1 沙门菌病及其侵袭机制

2 禽类对沙门菌感染的免疫应答

3 宿主特异性沙门菌的活疫苗

4 非宿主特异性沙门菌的活疫苗

5 结语

参考文献

第一章 快速检测肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌多重PCR方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结

致谢

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