流产布鲁氏菌胞内诱导基因鉴定及bab2-1152、bab2-1118和bab1-1222基因的研究

摘要

布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病，其病原布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌，布鲁氏菌无经典的毒力因子，如质粒、荚膜，外毒素等，其毒力主要体现在入侵宿主细胞并在其中繁殖的能力。因此鉴定布鲁氏菌胞内诱导基因对于研究其致病机制具有重要的意义。 在实验室前期研究中，我们通过基因芯片技术比较分析巨噬细胞内流产布鲁氏菌与体外培养条件下流产布鲁氏菌基因转录差异。在本研究中，我们建立了一种qRT-PCR方法检测布鲁氏菌胞内诱导基因的方法，通过特殊的细胞裂解液裂解细菌、固定细菌RNA的方法，成功分离了感染小鼠巨噬细胞的胞内细菌，通过qRT-PCR方法筛选鉴定了部分基因芯片中筛选的差异基因，鉴定了14个布鲁氏菌胞内环境中明显上调转录的基因，分别为bab2_1152，bab2_1118，bab1_1843，bab1_0596，bab1_1222，bab2_0707，bab2_0128，bab1_0211, bab2_0436, bab2_0436, bab2_0060, bab1_1952, bab1_0296, bab2_0369。对这些基因进行分析发现，它们参与了多种生物学功能，如信息存储和处理，细菌代谢等。说明布鲁氏菌在胞内环境中存活是通过一系列复杂的调控机制来实现的。 布鲁氏菌胞内诱导基因bab2_1152编码AraC样转录调控子，为进一步研究该基因的功能，在本研究中，我们通过基因定向缺失技术成功构建bab2_1152基因缺失株(△1152缺失株)，通过粘附和入侵试验显示，△1152缺失株增强了粘附巨噬细胞的能力，没有增加入侵巨噬细胞的数量，但其入侵效率明显低于野生株S2308，表明△1152缺失株减弱了入侵巨噬细胞的能力。胞内存活试验显示bab2_1152基因缺失后并不影响布鲁氏菌胞内存活的能力。 胞内诱导基因bab2_1118和bab1_1222分别编码布鲁氏菌的原儿茶酸2，3双加氧酶(Hpcd)和碱性磷酸酶(PhoA)，为进一步研究该蛋白的特性，在本研究中，我们在大肠杆菌中成功表达了hpcd和phoA基因，免疫小鼠后成功制备获得了鼠抗Hpcd和PhoA多克隆抗体，免疫印迹试验显示，Hpcd和PhoA蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，可能是一种有效的候选保护性抗原。 总而言之，本研究中成功建立了一种胞内诱导基因鉴定方法，通过定向缺失技术研究了bab2_1152基因的功能，成功表达了胞内诱导基因Hpcd和phoA，为进一步研究布鲁氏菌胞内存活机制提供理论研究资料。

目录

摘要

英文缩略名词对照表

第一部分 文献综述

1 布鲁氏菌概况

1．1 布鲁氏菌的危害

1．2 布鲁氏菌病原特点及分类

1．3 布鲁氏茵流行情况

1．4 布鲁氏菌的传播途径

2 布鲁氏菌感染过程及胞内存活机制

3 布鲁氏菌毒力因子

3．1 脂多糖

3．2 四型分泌系统

3．3 BvrR-BvrS双组分系统

3．4 环β-葡聚糖

3．5 超氧化物歧化酶

3．6 碱基切除修复(BER)

3．7 过氧化氢酶

3．8 其他毒力因子

4 本研究的目的和意义

第二部分 实验内容

第一章：荧光定量PCR验证布鲁氏菌胞内诱导基因

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章：流产布鲁氏菌bab2_1152缺失株构建及致病性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章：流产布鲁氏菌bab2_1118和bab1_1222的免疫学特性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文结论

参考文献

致谢

附录：攻读硕士学位期间发表的论文

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