辅助降血脂益生乳酸菌的筛选及其对高血脂大鼠肠道菌群的影响

摘要

本文从广西巴马长寿地区的人群肠道中分离筛选出体外辅助降血脂能力较强的乳酸菌，并研究其在高血脂大鼠体内的降血脂效果以及对高血脂大鼠肠道菌群的影响，从而探索乳酸菌在体内降血脂的可能机制，并为以肠道菌群为靶点进行的益生菌干预治疗提供理论依据。
　　1.利用选择性培养基从广西巴马长寿地区人群采集的粪便样品中分离乳酸菌，通过体外试验筛选出降胆固醇及甘油三酯能力较强的乳酸菌，然后进行模拟人工胃液、胆盐耐受性、抑菌及耐药性试验;并研究其生长菌体、热致死菌体及休眠菌体的胆固醇降解率及其在体外的降胆固醇方式。结果表明，从15份粪便样品中分离获得156株乳酸菌，其中Lp2、S10、Lf7及Hsryfm1301等16株乳酸菌的胆固醇及甘油三酯的降解率均分别大于30.35％和5.33％，Lp2、S10、Lf7及Hsryfm1301在pH3.0的人工胃液中存活率均大于63.00％，在含0.1％、0.3％及0.5％胆盐的培养基中存活率均大于15.00％; Hsryfm1301的抑菌能力较强于Lp2、S10及Lf7，对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为14.67mm、11.35mm及10.67mm; Hsryfm1301的耐药性低于Lp2、S10及Lf7，对头孢唑啉、头孢拉定、四环素、氯霉素、利福平素均敏感，对链霉素中度敏感，对青霉素G、诺氟沙星及环丙沙星均耐药;Hsryfm1301在含0.1％、0.3％及0.5％胆盐的培养基中的降胆固醇能力较强于Lp2、S10及Lf7，降解率分别为56.25％、28.91％及13.20％; Lp2、S10、Lf7及Hsryfm1301的生长菌体、热致死菌体及休眠菌体均能降低培养基中的胆固醇，Hsryfm1301生长菌体的胆固醇降解率为61.90％，高于Lp2、S10及Lf7; Hsryfm1301体外降胆固醇的主要方式为菌体吸收及共沉淀，分别占其总降解率的62.50％及36.50％。经API及16S rDNA测序将Hsryfm1301鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。
　　2.通过饲喂4周高脂饲料来建立高血脂大鼠模型，以降血脂药物血脂康作为阳性对照，研究L.rhamnosus hsryfm1301的菌体悬浮液、热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳在高血脂大鼠体内的降血脂效果。结果表明，饲喂4周高脂饲料，模型组大鼠血清中的胆固醇(Serum total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglycerides，TG)及低密度脂蛋白(Lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量显著高于对照组(P＜0.05)，分别为2.05mmol/L、1.98mmol/L、0.28mmol/L，表明高血脂大鼠模型建模成功;灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301发酵乳后，大鼠对饲料的利用率显著高于模型组(P＜0.05)，为29.46％;饲喂8周高脂饲料后，模型组大鼠的肝指数及体脂指数均显著高于对照组及L.rhamnosus hsryfm1301各处理组(P＜0.05)，分别为3.98和3.55。
　　灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301的各处理方式后，菌体悬浮液组及发酵乳组大鼠血清中TC、TG的含量显著低于模型组（P＜0.05），分别为1.50mmol/L、1.30mmol/L及1.53mmol/L、1.28mmol/L;菌体热致死组大鼠血清中TC、高密度脂蛋白(High density lipoproteincholesterol，HDL-C)及LDL-C的含量显著低于模型组（P＜0.05），分别为1.90mmol/L、0.38mmol/L及0.19mmol/L;菌体破碎液组大鼠血清中TC、TG及LDL-C的含量显著低于模型组(P＜0.05)，分别为1.78mmol/L、1.68mmol/L及0.17mmol/L;灌胃4周的血脂康后，大鼠血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量也显著低于模型组(P＜0.05)，分别为1.76mmol/L、1.65mmol/L、0.39mmol/L及0.19mmol/L。
　　灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301的菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳后，大鼠血清中氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)浓度显著高于模型组(P＜0.05)，分别为74.96U/mL、73.58U/mL及73.96U/mL，而热致死菌体对大鼠血清中的SOD浓度影响较小;菌体悬浮液组及发酵乳组大鼠粪便中胆固醇、甘油三酯和胆汁酸的含量显著高于模型组(P＜0.05)，分别为10.23μmol/g、4.25μ mol/g和28.87μmol/g及9.85μ mol/g、4.03μ mol/g和27.13μmol/g;菌体悬浮液组、菌体破碎液组与发酵乳组大鼠粪便中的水分含量显著高于模型组(P＜0.05)，分别为46.15％、45.35％及46.85％;通过透射电镜观察发现，L.rhamnosushsryfm1301菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳均能预防由高血脂引起的大鼠肝脏和心脏组织的病变。
　　3.利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术研究基础饲料、高脂饲料及L.rhamnosus hsryfm1301的菌体悬浮液、热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳对高血脂大鼠肠道菌群的影响。结果表明，饲喂4周高脂饲料增加了大鼠肠道中柔嫩梭菌属PCR-DGGE图谱的条带数，降低了肠道微生物16S rRNA基因V3区、拟杆菌属、乳酸菌及双歧杆菌属PCR-DGGE图谱的条带数，而L.rhamnosus hsryfm1301的各处理方式对大鼠肠道微生物的影响正好与之相反。
　　饲喂4周基础饲料及高脂饲料后，大鼠肠道中Klebsiella pneumoniae及Unculturedbacterium的丰度下降甚至消失，同时增加了大鼠肠道中柔嫩梭菌的种类，而对照组大鼠肠道中的UnculturedBacteroidetes bacterium TM1-40消失。试验第9周，灌胃4周L.rhamnosus hsryfm1301菌体悬浮液后，大鼠肠道中出现了Pantoea vagans及Clostridium thermocellum，对照组及模型组大鼠肠道中出现了Streptomyces coelicolor及Clostridiales genomo sp.，对照组大鼠肠道中Clostridium botulinum A str.Hall的丰度高于其它组;热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳使大鼠肠道中Ruminococcus bromii L2-63的丰度下降或消失，菌体悬浮液增加了大鼠肠道中Lactobacillus amylovorus GRL的丰度，菌体破碎液增加了大鼠肠道中Lactobacillusbuchneri NRRL B-30929的丰度，发酵乳则增加了大鼠肠道中Lactobacillus sp.的丰度;菌体悬浮液、菌体破碎液及发酵乳还增加了大鼠肠道中乳酸菌的种类，分别为Lactobacillusmurinus DLM3108、Lactobacillus gasseri ATCC33323及Lactobacillus sakei subsp.。
　　4.利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time ploymerase chain reaction，RT-PCR)的方法研究基础饲料、高脂饲料及L.rhamnosus hsryfm1301的菌体悬浮液、热致死菌体悬浮液、菌体破碎液及其发酵乳对高血脂大鼠肠道菌群的影响，并分析高血脂大鼠的肠道菌群与其血清血脂水平的相关性。结果表明，饲喂8周基础饲料显著增加了大鼠肠道中拟杆菌和肠球菌的数量(P＜0.05)，饲喂8周高脂脂饲料显著增加了大鼠肠道中柔嫩梭菌、肠球菌以及肠杆菌的数量(P＜0.05)，同时显著降低了拟杆菌、乳酸菌及双歧杆菌的数量(P＜0.05);L.rhamnosus hsryfm1301各处理方式干预4周后，菌体悬浮液显著增加了大鼠肠道中拟杆菌及乳酸菌的数量(P＜0.05)，并显著降低了柔嫩梭菌的数量(P＜0.05);热致死菌体悬浮液显著增加了大鼠肠道中拟杆菌及肠球菌的数量(P＜0.05)，并显著降低了柔嫩梭菌及肠杆菌的数量(P＜0.05);菌体破碎液显著增加了大鼠肠道中拟杆菌、乳酸菌及双歧杆菌的数量(P＜0.05)，并显著降低了柔嫩梭菌的数量(P＜0.05);发酵乳显著增加了大鼠肠道内拟杆菌及肠球菌的含量(P＜0.05)，同时显著降低了柔嫩梭菌及肠杆菌的数量(P＜0.05);高血脂大鼠肠道内柔嫩梭菌的数量同其血清中TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量呈显著正相关(P＜0.05)，肠道内乳酸菌及双歧杆菌的数量同肠杆菌的数量呈显著负相关(P＜0.05)。

目录

摘要

符合说明

第一章 文献综述

1 益生菌

1．1 益生菌的来源及种类

1．2 益生菌的筛选标准

1．3 益生菌的生理功能

2 人体肠道菌群

2．1 人体肠道菌群的组成及分布

2．2 人体肠道菌群的生理功能

2．3 人体肠道中重要的微生物

2．4 人体肠道菌群与疾病

3 血脂

3．1 血脂的生理功能

3．2 高脂血症的危害

3．3 高血脂症的药物治疗

3．4 长寿地区人群与血脂

4 人体肠道菌群与血脂

4．1 益生菌及肠道菌群对血脂的影响

4．2 高脂饮食对肠道菌群的影响

5 肠道菌群的研究方法

5．1 变性梯度凝胶电泳

5．2 实时荧光定量

5．3 Illumina MiSeq高通量测序

6 研究目的、意义及主要内容

6．1 研究目的与意义

6．2 主要研究内容

第二章 辅助降血脂益生菌的体外筛选

引言

1 材料和方法

1．1 主要仪器和设备

1．2 试剂与材料

1．3 试验菌株

1．4 常用试剂的配制

1．5 试验方法

1．6 统计学处理

2 结果与分析

2．1 乳酸菌的分离及其降胆固醇及甘油三酯能力

2．2 乳酸菌耐酸耐胆盐能力

2．3 乳酸菌抑制肠道致病菌能力

2．4 乳酸菌耐抗生素能力

2．5 乳酸菌降胆固醇的影响因素及体外降胆固醇的方式

2．6 乳酸菌的鉴定

3 讨论

4 小结

第三章 降血脂益生菌对高血脂大鼠血脂的影响

引言

1 材料和方法

1．1 主要仪器和设备

1．2 试剂与材料

1．3 饲料及动物来源

1．4 样品的配制

1．5 试验方法

1．6 统计学处理

2 结果与分析

2．1 菌株的毒性评价

2．2 大鼠的生理指标

2．3 大鼠血清的生化指标

2．4 大鼠肝脏中胆固醇及甘油三酯的含量

2．5 大鼠粪便中胆固醇、甘油三酯、胆汁酸及水分的含量

2．6 大鼠肝脏及心脏切片的观察

3 讨论

4 小结

第四章 应用PCR-DGGE技术研究降血脂益生菌对高血脂大鼠肠道菌群的影响

引言

1 材料和方法

1．1 主要仪器和设备

1．2 试剂与材料

1．3 常用试剂的配制

1．4 试验方法

1．5 PCR-DGGE条带分析

2 结果与分析

2．1 L．rhamnosus hsryfm 1301对高血脂大鼠肠道优势细菌的影响

2．2 L．rhamnosus hsryfm 1301对高血脂大鼠肠道柔嫩梭菌的影响

2．3 L．rhamnosus hsryfm 1301对高血脂大鼠肠道拟杆菌的影响

2．4 L．rhamnosus hsryfm 1301对高血脂大鼠肠道乳酸菌的影响

2．5 L．rhamnosus hsryfm 1301对高血脂大鼠肠道双歧杆菌的影响

3 讨论

4 小结

第五章 应用Real-time PCR技术研究降血脂益生菌对高血脂大鼠肠道菌群的影响

引言

1 材料和方法

1．1 主要仪器和设备

1．2 试剂与材料

1．3 常用试剂的配制

1．4 试验方法

1．5 统计学处理

2 结果与分析

2．1 大鼠肠道细菌Real-time PCR标准曲线

2．2 L．rhamnosus hsryfm 1301对高血脂大鼠肠道微生物数量的影响

3 讨论

4 小结

第六章 应用通量测序方法研究降血脂益生菌对高血脂大鼠肠道菌群的影响

引言

1 材料和方法

1．1 主要仪器和设备

1．2 试剂与材料

1．3 常用试剂的配制

1．4 试验方法

1．5 统计学处理

2 结果与分析

2．1 大鼠肠道微生物基因组DNA的扩增产物

2．2 大鼠肠道微生物物种序列数目

2．3 大鼠肠道微生物物种操作分类单元

2．4 大鼠肠道微生物物种稀释曲线及丰度分布

2．5 大鼠肠道微生物物种Alpha多样性

2．6 大鼠肠道微生物物种丰度及其差异性

2．7 大鼠肠道微生物物种主坐标分析

2．8 大鼠肠道微生物物种聚类

3 讨论

4 小结

全文结论

创新点

参考文献

附录

致谢

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