梅山猪断奶仔猪腹泻模型的建立及抗性基因的表达分析

摘要

腹泻是导致断奶仔猪死亡的主要疾病，给养猪业带来了巨大经济损失。E.coli F18菌株是引起断奶仔猪腹泻的主要病原菌。目前中国地方品种断奶仔猪抗E.coli F18的遗传基础和调控机制尚不清楚，而且国内地方品种对E.coli F18的抗性基因和遗传机制可能有别于外来引进品种。基因芯片及高通量测序等技术为E.coli F18抗性候选基因的筛选提供了有力手段，但其前提需要获得断奶仔猪E.coliF18抗性型和敏感型全同胞个体，因此地方猪品种极端表型个体有效的筛选和鉴定已成为其抗性遗传基础研究的关键和瓶颈。此外，研究报道针对仔猪细菌性腹泻，目前人为的细菌攻毒试验是获取素材的较好途径。本研究以中国地方品种—梅山猪断奶仔猪为研究对象，采用E.coli F18ac菌株攻毒试验，并利用肠道细菌检测、细菌计数以及小肠上皮细胞黏附试验等方法进行验证，以期获得E.coli F18抗性型和敏感型个体，为今后研究梅山猪抗E.coli F18遗传机理提供宝贵素材，同时也为中国地方猪品种细菌性疾病模型的建立提供指导和参考。其次，结合课题组前期在苏太猪上的研究进展，对鞘糖脂生物合成—球系列通路及炎症免疫通路相关基因在梅山猪攻毒群体中的表达水平进行初步探究，旨在分析梅山猪E.coli F18腹泻抗性的调控通路及关键基因，最终为国内地方猪品种E.coli F18腹泻的抗病育种提供一定的科学依据。主要试验结果如下:
　　1、梅山仔猪攻毒后出现腹泻、轻度腹泻和不腹泻3种不同表型。腹泻仔猪肠道内容物中的E.coli F18数量远多于正常仔猪;黏附试验发现腹泻仔猪小肠上皮细胞大量黏附E.coli F18，而正常仔猪小肠上皮细胞与E.coli F18基本不黏附;病理组织切片结果表明，重度腹泻仔猪病变肠道组织间隙充血，黏膜层绒毛脱落、长度缩短，由此可以推测E.coli F18与仔猪小肠上皮细胞受体结合后破坏了黏膜层绒毛的完整性，从而定居繁殖造成仔猪腹泻。综合上述结果，本试验仔猪腹泻确实由攻毒造成，获得了E.coli F18抗性型和敏感型仔猪全同胞个体，即成功建立梅山猪断奶仔猪腹泻模型，为今后猪细菌性腹泻遗传基础研究素材和抗病育种基础群的获得提供了切实有效的方法和途径。
　　2、试验采用RT-PCR技术对鞘糖脂生物合成—球系列及炎症免疫通路相关基因在梅山猪E.coli F18抗性型和敏感型个体间的表达水平进行探究。结果表明，鞘糖脂生物合成—球系列通路相关基因在抗性和敏感个体间的组织表达水平均没有显著差异（P＞0.05）;E.coli F18抗性组仔猪脾脏中的IL-1β、TNF-α基因表达量显著高于敏感组（P＜0.05），抗性组淋巴结中的TNF-α基因表达量显著高于敏感组(P＜0.05)，抗性组胸腺中的SLA-3基因表达量也显著高于敏感组(P＜0.05)，此外BPI基因在抗性仔猪十二指肠中的表达量极显著高于敏感个体(P＜0.01)。以上结果进一步表明中国地方猪品种与外来品种抗E.coli F18的遗传基础和调控机制确实存在差异，在外来品种中发挥重要调控作用的鞘糖脂生物合成—球系列通路并未在梅山断奶仔猪抗E.coli F18感染的过程中起到重要的调控作用，而炎症免疫通路及相关基因对于梅山断奶仔猪大肠杆菌抗性可能存在重要的调控作用。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 断奶仔猪腹泻对养猪业的影响

2 ETEC F18致病机理

3 中国地方猪品种ETEC F18抗病育种现状

4 仔猪细菌性腹泻模型研究进展

5 猪E．coli F18抗性调控通路和相关基因

5．1 鞘糖脂生物合成—球系列通路相关基因

5．2 TLR4信号通路相关基因

5．3 其他免疫相关基因

6 本研究的目的和意义

第二章 梅山猪断奶仔猪腹泻模型的建立

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 梅山猪仔猪攻毒前体内常见致腹泻病原检测结果

2．2 E．coli F18抗性与敏感型个体的筛选

2．3 肠道组织的病理剖检变化

3 讨论

第三章 梅山猪E．coli F18抗性型和敏感型资源群体的调控通路及免疫相关基因的表达差异分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的纯度与完整性

2．2 荧光定量引物常规PCR检测结果

2．3 目的基因和内参基因的扩增曲线和熔解曲线

2．4 各基因在梅山猪E．coli F18抗性型和敏感型个体间的表达水平分析

3 讨论

3．1 鞘糖脂生物合成—球系列通路相关基因E．coli F18抗性／敏感型梅山猪中的表达

3．2 TLR4信号通路相关基因在E．coli F18抗性／敏感型梅山猪中的表达

3．3 免疫相关基因在E．coli F18抗性／敏感型梅山猪中的表达

3．4 小结

全文小结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表学术论文

参与申请国家发明专利

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