银杏胚珠非编码小RNA的鉴定和分析

摘要

素有“活化石”之称的银杏（Ginkgo biloba L.），被认为是地球上继蕨类物种之后出现最早的种子植物之一。银杏起源历史悠久，其生殖过程表现出独特的性状，尤其是雌性生殖器官胚珠的生长与发育，更是具有许多独特的原始特征。目前大多数研究集中在有关银杏胚珠的微观形态结构、胚珠组织形成和生理生化变化等方面，而有关调控银杏胚珠生长发育的分子机制方面鲜有报道。MicroRNAs（miRNAs），是一类内源性的、单链的、长度约为22个核苷酸(nt)的非编码小RNA，在真核生物中进化具有高度保守性，通过直接对靶基因切割或抑制靶基因翻译的手段，参与到植物生长发育、信号转导过程和环境胁迫响应等生命进程的各个方面。因此，对银杏胚珠开展miRNA的鉴定与功能研究具有重要的意义，可为进一步研究银杏胚珠生长发育的分子机理提供有力帮助。
　　本研究中，以银杏胚珠为实验材料，采用高通量测序技术与生物信息学分析技术相结合的方法，鉴定和分析了银杏胚珠的miRNA及其靶基因。取得主要结果如下:
　　(1)通过测序，从银杏胚珠中总共得到12，121，385个高质量的sRNA序列，去除3'接头缺失序列、5'接头污染序列、无插入片段、小于18nt的短序列及Poly A序列等低质量序列后，最终得到11，919，364（1，991，395 unique）条干净序列。
　　(2)对银杏胚珠小RNA文库中的clean reads进行分析与分类注释。文库中的小RNA长度集中在19-24 nt之间，符合典型miRNA长度分布。通过比对基因组，其中包含核糖体RNA(rRNA)有519，513条序列(31，039 unique)，占到sRNA总数的4.36％(1.56％ unique);小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）5，769条序列(1，014unique)，占到sRNA的0.05％(0.05％ unique);核仁小RNA(small Nucleolus RNA，snoRNA)1，858条序列(376 unique)，占总数的0.02％(0.02％ unique);转运RNA(transfer ribonucleicacid，tRNA)203，471条序列(6，636unique)，占总数的1.71％;未注释(unannatation)的sRNA8，627，585条序列(1，932，584unique)，占到总数的72.38％(97.05％ unique)。
　　(3)将胚珠的sRNA序列比对到miRBase数据库（miRBase20.0）中所有植物的miRNA成熟序列以及前体序列，最终比对得到19，746条唯一同源序列，经过严格筛选之后，最终鉴定得到保守序列144条，隶属于35个miRNA家族。
　　(4)将小RNA注释分析去除各种小RNA序列以后得到的未注释序列，用来进行新的miRNA预测。得到新的miRNA种数为99种，总表达量为132，843。在对新的miRNA进行首位碱基偏向性分析中发现，银杏胚珠中19-24nt的首位碱基对碱基U具有偏向性，符合成熟序列首位碱基对碱基U的偏向性要求。
　　(5)应用psRNATarget软件，对银杏胚珠的miRNA进行靶基因预测，银杏胚珠中已知的445个miRNA，预测得到2，062个靶基因，靶基因位点数为2，487个;123个新的miRNA，预测得到靶基因898个，共有靶基因位点数1，331个。GO富集分析发现这些靶基因的功能参与银杏胚珠的代谢过程、细胞进程等生长发育的各个生命活动进程。
　　(6)对银杏胚珠的靶基因功能注释分析发现，大部分靶基因为植物转录因子，我们从中挑选出具有前体序列，并且与光合作用、代谢合成、抗病以及信号转导等功能相关的14个已知的miRNA和表达量比较高的11个新的miRNA，应用亚克隆技术，进行前体验证，最终得到10个miRNA前体与Illumina测序结果完全匹配，7个低于3个碱基错配。
　　(7)对银杏胚珠与银杏雌株叶片中的miRNA的表达量进行差异分析，发现已知的miRNA中胚珠相对于雌株叶片有300个上调，171个下调，73个无显著差异;新的miRNA中胚珠相对于雌株叶片有46个上调，47个下调，21个无显著差异。
　　(8)根据上面靶基因功能以及前体验证结果，我们从中一共挑选出19个miRNA前体序列进行荧光定量PCR实验，以两个不同时期的银杏胚珠与银杏雌株叶片为实验材料，分析miRNA在同一时期不同组织中以及同一组织不同时期的表达差异性。
　　综上，本研究通过对银杏胚珠中miRNA的鉴定与分析，揭示了银杏胚珠中存在较多数量的小RNA，并且这些小RNA参与到了银杏的生长发育、形态建成以及信号转导等各个生命进程中，这也预示了银杏胚珠中可能存在着复杂的转录后基因表达调控机制，为进一步有关银杏胚珠的分子机制研究提供有力帮助。

目录

摘要

英文缩写及中英文对照表

第一章 文献综述

1．miRNA的研究进展

1．1 植物中miRNA的发现

1．2 植物中miRNA的特征和生物合成机制

1．3 植物中miRNA的功能

1．4 miRNA的研究方法

2．银杏的研究进展及本研究的目的与意义

2．1 银杏胚珠的研究进展

2．2 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株和质粒载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．1．5 所需试剂配制

2．1．6 所需网站与软件

2．2 实验方法

2．2．1 银杏胚珠与雌株叶片的总RNA的提取

2．2．2 RT-PCR实验

2．2．3 目的片段的克隆

2．2．4 DNA片断的回收和连接

2．2．5 大肠杆菌转化

2．2．6 菌落阳性鉴定和序列比对

2．2．7 质粒的提取

2．2．8 实时荧光定量PCR

2．2．9 深度测序及数据处理

第三章 结果与分析

3．1 银杏胚珠小RNA的初级信息分析

3．2 银杏胚珠小RNA的高级信息分析

3．2．1 基因组比对

3．2．2 Rfam(10．1)数据库以及Genbank比对

3．2．3 小RNA分类注释

3．3 银杏胚珠已知的miRNA碱基偏向性分析

3．4 银杏胚珠生物信息学分析

3．4．1 已知的miRNA分析

3．4．2 新的miRNA预测

3．4．3 已知的和新的miRNA靶基因预测

3．4．4 已知的和新的miRNA的靶基因GO富集分析

3．5 银杏胚珠已知的和新的前体序列验证分析

3．6 银杏胚珠与银杏雌株叶片中miRNA差异分析

3．6．1 已知的miRNA和新的miRNA差异分析

3．6．2 不同时期miRNA表达量差异分析

第四章 结果与讨论

4．1 深度测序的可行性分析

4．2 小RNA数据库的质量分析

4．3 保守的和新的miRNA序列分析

4．4 靶基因预测及其功能分析

参考文献

致谢

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