水稻纹枯病菌PG基因的克隆、表达及致病性分析

摘要

纹枯病是世界各水稻产区广泛发生、危害严重的一种重要病害。其病原菌有性态为瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris(Frank) Donk]，无性态为立枯丝核菌[Rhizoctonia solaniKühn]。该病菌可以侵染水稻、大豆、玉米、大麦、狗牙根和狗尾草等43科200多种植物，引起纹枯和立枯等症状。病菌与寄主互作过程中可分泌多种重要的细胞壁降解酶，并通过这些酶降解寄主细胞壁，从而达到侵入寄主的目的，多聚半乳糖醛酸酶则是其中最重要的一种胞壁降解酶。
　　本研究以水稻纹枯病强致病菌株YN-7为研究对象，采用PCR及RT-PCR方法克隆了3个完整的多聚半乳糖醛酸酶基因。其中PG6934基因全长1633bp，包含6个内含子，其cDNA全长1311bp(KP896519)，编码436个氨基酸，前16个氨基酸为信号肽序列;PG9039基因全长943bp，包含4个内含子，其cDNA全长720bp(KP896520)，编码239个氨基酸;PG9605基因全长1466bp，包含8个内含子，其cDNA全长1038bp(KP896521)，编码345个氨基酸。生物信息学分析表明，PG6934、PG9039和PG9605均含有PG特有的保守结构域NTD、DD、SHG和RIK。其中，PG6934的4个结构域位于225NTD、248DD、270SHG和310RIK;PG9039的4个结构域位于58NTD、80DD、101GHG和133RIK;而PG9605的4个结构域位于130ETD、153DD、175SHG和211RIK。PG6934的10个半胱氨酸残基形成5个二硫键;PG9039的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键;而PG9605的8个半胱氨酸残基形成4个二硫键。三个PG的二级结构均以α-螺旋、β-折叠和卷曲为其基本结构单元，跨膜结构预测表明它们均以从胞内向胞外分泌为主。
　　将3个多聚半乳糖醛酸酶基因分别连接到原核表达载体pET-28a，并转化至大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。结果表明，无论是上清还是经超声波破碎处理或反复冻融处理的菌体，均检测不到多聚半乳糖醛酸酶活性，包涵体变性复性后仍不具活性。将3个新基因和本实验室以前克隆得到的多聚半乳糖醛酸酶基因RsPG1(KP896518)分别构建到真核表达载体pPIC9K，转化受体毕赤酵母GS115，经甲醇诱导表达，上清均具有多聚半乳糖醛酸酶活性，工程菌GS-PG6934-7、GS-PG9039-5、GS-PG9605-8和GS-RsPG1-10酶活性最高，分别为101.21U/mL、91.09U/mL、91.09U/mL和267.21U/mL。采用针刺法将粗酶液接种至水稻叶鞘，48h后出现明显的坏死斑。用4种粗酶液处理四叶期水稻叶鞘，对水稻叶鞘均可产生浸解作用，处理24h后，还原糖量(OD540)分别为1.387、1.061、1.053和1.664，细胞损伤率分别为78.4％、62.6％、55.5％和90.0％。Real-time PCR分析表明，这几个基因在纹枯病菌侵染水稻过程中，均能上调表达，而且以接种后48h表达量最高，但不同基因之间表达量差异极显著，说明这些基因均参与了病原菌对寄主的致病过程，但各基因作用大小不同。

目录

摘要

符号及英文缩略词与中文对照表

文献综述

1 水稻纹枯病研究进展

1．1 发生与为害

1．2 病原物及其致病作用

1．3 品种抗病性

1．4 防治及存在问题

2 植物病原真菌致病基因种类

2．1 与侵染结构形成有关的基因

2．2 与细胞壁降解有关的基因

2．3 与寄主代谢反应产物有关的基因

2．4 毒素基因

2．5 与信号传导有关的基因

2．6 其他功能的致病基因

3 植物病原真菌PG基因研究现状

3．1 真菌胞壁降解酶种类

3．2 PG基因

3．3 PG基因编码产物及其功能

4 基因的异源表达

4．1 原核表达

4．2 真核表达

5 选题的目的和意义

材料与方法

1 供试材料

1．1 生物材料

1．2 主要试剂

1．3 仪器

1．4 培养基

1．5 贮存液配制

1．6 溶液配制

2 核酸的提取

2．1 基因组DNA的提取

2．2 总RNA的提取(Promega SV总RNA提取试剂盒)

2．3 质粒的提取

3 PG基因的克隆与序列分析

3．1 PCR扩增及产物回收

3．2 DH5α感受态细胞的制备

3．3 目的片段的连接与转化

3．4 阳性克隆子的筛选与测序

3．5 PG基因及其表达产物的生物信息学分析

4 PG基因的原核表达

4．1 原核表达载体的构建

4．2 BL21感受态细胞的制备

4．3 阳性重组质粒转化BL21

4．4 阳性转化子的筛选

4．5 PG基因的诱导表达

4．6 表达产物的SDS-PAGE分析

5 PG基因的真核表达

5．1 真核表达载体构建

5．2 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备

5．3 阳性重组质粒的线性化与转化

5．4 转化子的甲醇利用表型筛选

5．5 转化子的PCR鉴定

5．6 外源基因多拷贝整合转化子筛选

5．7 PG基因的诱导表达

6 表达产物的生物学活性测定

6．1 表达产物的酶活性测定

6．2 表达产物的致病性测定

7 PG基因表达水平检测

7．1 qRT-PCR引物设计

7．2 样品收集与总RNA提取

7．3 qRT-PCR分析

结果与分析

1 PG基因的克隆

2 生物信息学分析

2．1 PG基因序列分析

2．2 PG基因编码产物的生物信息学分析

3 PG基因的原核表达

4 PG基因的真核表达

4．1 真核表达载体的构建

4．2 质粒转化及酵母转化子的筛选

4．3 真核表达产物酶活性测定

4．4 真核表达产物致病性测定

4．5 PG基因在病菌侵染过程中的荧光定量PCR分析

讨论

1 PG的结构

2 PG的功能

3 PG的生物学特性

4 PG基因的异源表达

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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