亚洲玉米螟免疫相关模式识别受体基因β-1,3-GRP的cDNA克隆及表达分析

摘要

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)幼虫体内一种与免疫相关的模式识别受体β-1，3-葡聚糖识别蛋白(βGRPs)表达调控的分子机理，本文利用RACE技术从亚洲玉米螟幼虫体内克隆得到β-1，3-GRP的cDNA序列，对β-1，3-GRP基因序列进行了生物信息学分析，摸索了原核表达β-1，3-GRP蛋白的条件。对亚洲玉米螟5龄幼虫进行细菌注射，通过荧光定量实时PCR检测注射前后β-1，3-GRP基因在不同组织中mRNA水平上的表达变化情况。主要研究结果如下:
　　(1)采用RT-PCR及RACE技术从亚洲玉米螟幼虫中克隆β-1，3-GRP基因全长cDNA序列。该基因全长1570 bp核苷酸(GenBank登录号:KF425324)，包含一个1452 bp的开放阅读框(ORF)，一个14bp的5'非编码区(5'UTR)和一个104bp的带有加尾信号的3'非编码区(3'UTR)。开放阅读框从第15个核苷酸开始，终止于第1469个核苷酸，起始密码子ATG，终始密码子TGA，由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为484个氨基酸。Of-β-1，3-GRP蛋白的计算分子量约为53.37 kDa，估测等电点pI为6.46。生物信息学分析表明:β-1，3-GRP蛋白无跨膜结构域，N端含有信号肽，切割位点为25与26位氨基酸之间，有2个糖基化位点，分别位于139位和141位，含有44个磷酸化位点，均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明:Of-β-1，3-GRP的氨基酸序列与棉铃虫Helicoverpaarmigeraβ-1，3-GRP3、家蚕Bombyx moriβ-1，3-GRP2、烟草天蛾Manduca sexta GNBP、烟草天蛾M.sextaβ-1，3-GRP3、玉带凤蝶Papilio polytes革兰氏阴性菌结合蛋白3、柑橘凤蝶Papilio xuthus革兰氏阴性菌结合蛋白3高度同源。
　　(2)采用pET-28b原核表达系统对β-1，3-GRP蛋白进行了原核表达，结果显示，Of-βGRP重组蛋白在IPTG的梯度诱导之后在沉淀中均有大量表达，重组表达蛋白质分子的大小与预测蛋白分子量大小一致，约为53 kDa。pET-28b-β-1，3-GRP在28℃温度下，可以明显看到1.0 mmol/L和1.2 mmol/L IPTG诱导下碎菌上清中有明显的蛋白表达。
　　(3)通过Real time PCR检测注射后不同时间(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24 h、36 h)β-1，3-GRP基因在亚洲玉米螟幼虫不同组织（血细胞、中肠、脂肪体、体壁）中的表达变化。结果表明:血细胞中，注射后6h，生理盐水组、枯草芽孢杆菌组和大肠杆菌组β-1，3-GRP表达水平均开始上升(p＜0.05)。12h后，大肠杆菌处理组和枯草芽孢杆菌组β-1，3-GRP表达水平都达到峰值，随着时间延长，表达量开始急剧下降。在中肠和脂肪体中，三个处理组β-1，3-GRP表达平均呈先增后降的趋势，但在中肠中，大肠杆菌处理组表达水平变化趋势较枯草芽孢杆菌处理组明显，在脂肪体中二者差异不明显。在中肠组织中，β-1，3-GRP作为一种响应革兰氏阴性菌表面β-1，3-葡聚糖的受体，对大肠杆菌的响应要较革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌快。在体壁组织中，与对照组相比，生理盐水组β-1，3-GRP基因表达水平变化不大，枯草芽孢杆菌细组β-1，3-GRP基因表达水平4h时达到峰值，之后缓慢下降，而大肠杆菌组β-1，3-GRP基因表达水平2h时达到峰值，之后缓慢下降。总体来说，不同组织β-1，3-GRP基因对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的反应速度以及注射后表达量的变化存在差别，但是两种细菌都能够引起β-1，3-GRP基因在转录水平上的表达量显著变化。

目录

摘要

文献综述

1 昆虫的天然免疫系统

2 模式识别受体在昆虫天然免疫中的作用

2．1 Toll和Imd两种信号途径

2．2 模式识别受体

3 国内外关于βGRP的研究进展

4 研究目的和意义

1 前言

2 材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 总RNA提取

2．5 cDNA第—链的合成

2．6 亚洲玉米螟幼虫β-1，3-GRP基因中间片段扩增

2．6．1 引物设计与合成

2．6．2 Of-β-1，3-GRP基因中间片段RT-PCR扩增

2．6．3 目的基因片段的回收纯化

2．6．4 目的片段与克隆载体连接

2．6．5 连接载体转化

2．6．6 单菌落PCR检测

2．6．7 测序

2．7 Of-β-1，3-GRP基因的3’-RACE

2．7．1 引物设计

2．7．2 操作步骤

2．7．3 3’-RACE产物的克隆测序

2．8 Of-β-1，3-GRP基因的5’-RACE

2．8．1 Takara 5’-RACE反应原理和引物设计

2．8．2 操作步骤

2．8．3 5’-RACE产物的克隆测序

2．9 序列的生物信息学分析

2．9．1 数据库搜索及亚洲玉米螟Of-β-1，3-GRP基因编码蛋白的理化性质分析

2．9．2 亚洲玉米螟Of-β-1，3-GRP基因编码蛋白的结构和功能预测

2．9．3 基于昆虫Of-β-1，3-GRP核苷酸序列推导的氨基酸序列的系统进化树构建

2．10 Of-β-1，3-GRP重组蛋白原核表达探索

2．10．1 重组表达质粒pET-28b(+)-Of-β-1，3-GRP的构建

2．10．2 重组表达

2．11 亚洲玉米螟Of-β-1，3-GRP基因表达的Real time PCR检测

2．11．1 细菌诱导物的制备

2．11．2 亚洲玉米螟幼虫细菌诱导物的注射及解剖

2．11．3 Real time PCR检测

2．11．4 数据分析

3 结果与分析

3．1 Of-β-1，3-GRP基因cDNA全长序列

3．1．1 Of-β-1，3-GRP中间片段的克隆

3．1．2 Of-β-1，3-GRP基因全长cDNA序列的3’RACE和5’RACE

3．1．3 Of-β-1，3-GRP基因全长cDNA序列的克隆

3．2 Of-β-1，3-GRP基因的生物信息学分析

3．2．1 Of-β-1，3-GRP基因的核苷酸序列和氨基酸序列

3．2．2 Of-β-1，3-GRP基因核苷酸序列和氨基酸序列的BlastP分析

3．2．3 Of-β-1，3-GRP基因的系统进化树

3．2．4 Of-β-1，3-GRP基因信号肽、跨膜结构、翻译后修饰以及琉水性分析

3．2．5 Of-β-1，3-GRP的三维结构以及功能结构域分析

3．3 Of-β-1，3-GRP基因的原核表达

3．3．1 Of-β-1，3-GRP基因表达载体的构建

3．3．2 pET-28b-Of-β-1，3-GRP原核表达条件的筛选

3．4 亚洲玉米螟幼虫Of-β-1，3-GRP基因mRNA表达水平分析

3．4．1 不同处理后5龄幼虫血细胞中Of-β-1，3-GRP基因mRNA水平的表达量变化

3．4．2 不同处理后5龄幼虫中肠中Of-β-1，3-GRP基因mRNA水平的表达量变化

3．4．3 不同处理后5龄幼虫脂肪体中Of-β-1，3-GRP基因mRNA水平的表达量变化

3．4．4 不同处理后5龄幼虫体壁中Of-β-1，3-GRP基因mRNA水平的表达量变化

4 讨论

4．1 Of-β-1，3-GRP的序列和蛋白结构分析

4．2 Of-β-1，3-GRP的原核表达、纯化及Western blotting分析

4．3 细菌注射对Of-β-1，3-GRP基因mRNA表达水平的影响

4．4 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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