凋亡及自噬在HVJ-E致A549和A549/DDP细胞死亡中的作用机制

摘要

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都有明显升高的趋势，肺癌是一种多因素的疾病，吸烟是引起肺癌的主要因素之一。目前肺癌的治疗主要以手术治疗、化学治疗和放射治疗为主，但存活率普遍不高，所以，我们仍需寻求一种新的方法来治疗肺癌。研究表明，灭活的仙台病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope，HVJ-E)不仅可以作为载体传递抗肿瘤药物，激活多重抗肿瘤免疫，同时还能直接杀伤肿瘤。在本研究中，我们发现HVJ-E可直接诱导人肺腺癌细胞(A549)、耐顺铂人肺腺癌细胞(A549/DDP)死亡，并初步探讨其抗肿瘤机制。
　　首先，我们通过实验观察HVJ-E作用A549、A549/DDP细胞后，RIG-Ⅰ和IFN-β的表达情况。Western Blot和ELISA检测显示，经HVJ-E刺激后，RIG-Ⅰ的表达量增加，诱导IFN-β的产生，并呈剂量-效应关系。这表明HVJ-E与A549、A549/DDP细胞发生了融合，断裂的病毒基因组被RIG-Ⅰ识别，从而导致A549、A549/DDP细胞中的IFN-β含量随HVJ-E浓度的增加而增加。
　　其次，我们探索HVJ-E对A549、A549/DDP细胞繁殖和生长的影响。用HVJ-E处理A549、A549/DDP细胞，倒置显微镜下观察，发现两种细胞均出现生长停滞、皱缩和破裂的现象，同时用Hoechst33258染色试剂盒可以观察到细胞染色质皱缩，细胞核碎裂。CCK-8检测结果显示，用100～800 MOI HVJ-E分别处理A549、A549/DDP细胞24小时后，细胞的活力与对照组相比明显下降，并呈剂量依赖关系。流式细胞术FACS法检测显示，经HVJ-E处理后，A549、A549/DDP细胞均产生明显的凋亡，且呈剂量依赖关系。由此可以说明HVJ-E可以直接导致A549、A549/DDP细胞凋亡。
　　然后，我们用Western Blot法检测p53、Bcl-2/Bax、Caspase信号通路的相关蛋白。p53的表达量随HVJ-E浓度增加有升高趋势，Bcl-2/Bax却呈下降趋势，caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP、Caspase-8、Caspase-9随HVJ-E浓度升高而活性升高，最终都可检测到碎裂的形式。为进一步确认HVJ-E诱导的A549、A549/DDP细胞凋亡是否与Caspase通路有关，我们用caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK分别预处理细胞后加HVJ-E处理，结果显示，碎裂的caspase-3和PARP被显著抑制且细胞凋亡率也被显著抑制。该实验证明Caspase信号通路参与HVJ-E诱导的A549、A549/DDP细胞凋亡。
　　接着，我们研究了MAPK通路是否参与HVJ-E诱导的A549、A549/DDP细胞凋亡。Western Blot法检测p-p38、p-JNK、p-ERK1/2，结果p38、JNK、ERK1/2均被激活。为进一步确认MAPK通路对细胞凋亡的影响，我们分别利用p38抑制剂SB203580(10μM)、JNK抑制剂SP600125(A549:8μM、A549/DDP:10μM)、ERK抑制剂PD98059（20μM）预处理细胞30分钟后再加HVJ-E，Western Blot结果显示p38、JNK、ERK1/2磷酸化均被明显抑制，同时用CCK-8测定的细胞活力显示，SB203580、SP600125、PD98059均可以提高细胞活力。以上结果表面MAPK通路在HVJ-E诱导的A549、A549/DDP细胞凋亡中发挥作用。
　　最后，我们研究了自噬在HVJ-E引起A549、A549/DDP细胞死亡中的作用，我们利用GFP-LC3质粒和Lipofectamine2000转染A549、A549/DDP细胞，分别设阴性对照组、800 MOI HVJ-E、Rapa组，24小时后倒置荧光显微镜下观察自噬现象。结果显示，Rapa组出现大量自噬小体，HVJ-E处理组出现少量自噬小体。再用Western Blot法检测自噬相关蛋白的表达情况，结果显示p-mTOR、p-p70S6K的表达量均随着HVJ-E浓度的增加而减小。由此说明自噬参与了HVJ-E促进细胞的死亡。再利用Rapa和CQ分别预刺激A549、A549/DDP细胞，Western Blot法检测可发现A549细胞，与HVJ-E组对照组相比，CQ组cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达量明显升高，Rapa组降低，而A549/DDP细胞的结果正好相反。CCK-8测定每组细胞的活力，结果显示，A549细胞，CQ组的细胞死亡率最高;A549/DDP细胞，Rapa组的细胞死亡率最高。以上结果显示，对于A549细胞，抑制自噬可以促进HVJ-E引起的细胞凋亡，而对于A549/DDP细胞，激活自噬可以促进HVJ-E引起的细胞凋亡。

目录

摘要

符号说明

文献综述

1．仙台病毒基本概述

1．1 仙台病毒的形态结构

1．2 仙台病毒的分子生物学特征

1．3 灭活仙台病毒治疗肿瘤的研究进展

2．细胞凋亡

2．1 细胞凋亡特征

2．2 细胞凋亡的分子机理

2．3 细胞凋亡的途径

3．细胞自噬

3．1 细胞自噬的过程

3．2 细胞自噬的特性

3．3 自噬对肿瘤发生的双重作用

第一部分 HVJ-E诱导A549、A549／DDP细胞凋亡

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第二部分 HVJ-E致A549、A549／DDP凋亡的作用机制

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第三部分 自噬在HVJ-E致A549、A549／DDP凋亡中的作用

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

全文结论

参考文献

致谢

声明