禽源大肠杆菌质粒介导氟喹诺酮类耐药基因的检测及中药消除耐药性研究

摘要

目前已报道的喹诺酮类耐药机制有多种，其中由质粒介导的耐药机制合理地解释了细菌耐药性的高突变率及多种抗生素的耐药相关性。质粒上携带的耐药基因只介导细菌对喹诺酮类药物的低水平耐药，但是能够诱导靶位基因突变，引起高水平耐药。因此，国内外研究者一直在积极寻找能够消除细菌耐药性的方法。中药因其天然环保、副作用小、应用安全等优点，受到了研究者的青睐。
　　本研究采用PCR扩增技术对83株禽源大肠杆菌进行质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因的检测，同时微量肉汤稀释法测定恩诺沙星(ENR)的最小抑菌浓度。对其中6株大肠杆菌进行10味中药的抑菌试验，选取五味子、黄连、黄芩3味中药对6株耐药菌进行消除培养，筛选消除菌并通过抑菌试验及PCR方法确定耐药性及耐药基因的消除情况，同时RT-qPCR分析消除前后耐药基因表达量的变化。研究结果如下:
　　83株禽源大肠杆菌PMQR基因检出率为86.7％（qnr、aac(6'）-Ib-cr、oqxAB分别为49.4％、83.1％、9.6％，未检出qnrC和qepA基因）。PMQR基因在禽源大肠杆菌中具有很高的流行率。抑菌试验显示有50株大肠杆菌对ENR耐药，占全部菌株的比例为60％。说明本研究中禽源大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药情况严重。
　　10种中药中山楂、五倍子、金银花、黄柏、鱼腥草的抑菌效果不明显，艾叶和连翘抑菌效果相对较好，五味子、黄连、黄芩的抑菌效果最好。高、中、低剂量的五味子、黄连、黄芩提取液对6株大肠杆菌的耐药性消除率在0-100％之间，高剂量组的消除效果最好。说明中药具有消除耐药性的作用而且存在完全消除的可能。进一步研究发现，中药也具有消除耐药基因的作用，黄连对耐药基因的消除率最高可达100％。不过不同中药和不同菌株间的消除效果有差异，而且并不都是高剂量组消除效果最好。阳性对照SDS对某一基因的消除率因菌株的不同有差异。RT-qPCR结果显示3味中药消除培养后，耐药基因mRNA表达量均下降，表明耐药基因mRNA表达水平与细菌耐药的强度有关。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 禽源大肠杆菌的耐药现状

2 耐药性的产生与影响因素

3 喹诺酮类药物的研究进展

3．1 喹诺酮类药物的应用发展

3．2 喹诺酮类药物的作用机理

4 细菌对喹诺酮类药物的耐药机制

4．1 药物作用靶位基因的突变

4．2 主动外排作用

4．3 膜通透性改变

4．4 质粒介导的喹诺酮类耐药

5 细菌耐药质粒消除的研究进展

5．1 物理方法消除耐药质粒

5．2 化学方法消除耐药质粒

5．3 药物法消除耐药质粒

5．4 中药法消除耐药质粒

6 本研究的目的意义

第二章 质粒介导的氟喹诺酮类耐药基因的检测及体外抑菌试验

1 材料

1．1 仪器与设备

1．2 主要试剂

1．3 试验菌株

2 试验方法

2．1 培养基的制备

2．2 细菌的复苏和保存

2．3 PMQR基因的检测

2．4 qnrD基因的TA克隆

2．5 恩诺沙星对大肠杆菌MIC测定

3 结果与分析

3．1 PMQR基因检测结果

3．2 耐药基因qnrD的TA克隆

3．3 体外抑菌试验结果

4 讨论

5 小结

第三章 中药对质粒介导耐药性的消除作用及耐药基因表达量的影响

1 材料

1．1 仪器与设备

1．2 主要试剂

1．3 试验菌株

2 试验方法

2．1 中药提取液的制备

2．2 含SDS LB肉汤培养基的制备

2．3 含药LB琼脂培养基的制备

2．4 微量肉汤稀释法测定中药MIC

2．5 细菌的耐药性消除培养

2．6 消除菌的筛选与鉴定

2．7 耐药基因消除菌的筛选

2．8 RT-qPCR检测耐药基因表达量的变化

3 结果与分析

3．1 不同中药对大肠杆菌MIC测定结果

3．2 大肠杆菌耐药性的消除率

3．3 耐药性消除菌PMQR基因的消除率

3．4 耐药基因aac(6’)-Ib-cr表达量的变化

4 讨论

4．1 中药对禽源大肠杆菌的抑菌效果

4．2 中药对大肠杆菌耐药性的消除作用

4．3 耐药基因的消除效果

4．4 消除前后耐药基因表达量的变化

4．5 中药消除耐药性的作用机理

5 小结

全文结论

参考文献

在读期间发表的文章

致谢

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