Shlnc-EC6/miR-451对小鼠红细胞脱核病理生理机制的影响及鸡血藤总黄酮干预作用的研究

摘要

红细胞发育的关键一步是有核红细胞脱核成为网织红细胞，然后形成成熟的红细胞。在红细胞体外培养、各种类型的贫血和红细胞发育失调疾病的时候，均有有核红细胞的增多而导致红细胞脱核障碍，因此研究红细胞脱核已成为当前科学研究的迫切需要，其目的是为了开发新的血源、改善相关疾病引起的贫血症状和治疗红系疾病提供重要的诊断和治疗途径，这有着重要的生理和病理意义。
　　Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1，Rac1）是Rac的一种亚型，属于GTPase家族成员。Rac1发挥的主要功能包括促进细胞增殖和参与细胞骨架的形成和重排，提高细胞的成活率，并在细胞粘附和转移等方面发挥关键性的作用。研究表明在红细胞发育的后期下调Rac GTPase就能阻碍红细胞的脱核但并不影响红细胞的增殖和分化。然而Rac1的表达变化在小鼠红细胞的脱核中作用及具体机制不明。
　　shlnc-EC6是一种长链非编码RNA(Longnoncoding RNA，Lnc-RNA)，这类RNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，没有编码蛋白的能力。LncRNA参与编码基因表达调控的表观遗传机制，成为转录组很重要的一个部分，能够直接调控靶基因的转录与蛋白的降解等，在基因组印记、转录调控及人类疾病等方面有着广泛的功能。有研究结果表明超过400多个长链非编码RNA在红系发育中有着重要的生物学功能，其中长链非编码shlnc-EC6与红细胞的脱核有关。shlnc-EC6是否能通过靶定Rac1基因影响红细胞的脱核，有待实验的研究。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码、具调控功能的小分子单链RNA，参与机体的生长、发育、分化、代谢和死亡等几乎所有重要的生理过程。miRNA能够结合靶mRNA3'非翻译区(3'untranslated region，3'UTR)，并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和（或）抑制翻译过程而发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用，成为人类某些肿瘤的潜在标志物。有研究显示，miR-451在斑马鱼的红细胞成熟过程中发挥重要作用，且生物信息学提示GATA23'UTR和miR-451存在保守性绑定结合位点，那么在小鼠红细胞成熟过程中中miR-451是否能通过靶定Rac1基因影响红细胞的脱核，值得进一步研究。
　　最新有研究指出，长链非编码RNA具有竞争或协同内源性RNA的功能，能与 microRNA促进或竞争结合mRNA3'UTR区的绑定位点，能够促进或抑制microRNA对靶基因mRNA的降解作用，从而调节靶基因mRNA及其蛋白的表达。已有研究显示了lncRNA与microRNA相互作用机制，在肝癌组织中lncRNA-HULC异常高表达且具有典型的mRNA样结构，但不编码蛋白，因此研究者认为HULC RNA可能扮演着分子诱饵和自然microRNA海绵的角色，HULC RNA能吸附miR-372，抑制miR-372的表达，miR-372靶向抑制PRKACB，PRKACB可以磷酸化激活CREB，进入胞核后又结合到HULC启动子区域进一步激活HULC的表达。那么在红细胞成熟脱核过程中长链非编码shlnc-EC6与miR-451是怎样的调节关系，能否通过与miR-451的协同结合而调节miR-451靶基因Rac1的表达，迄今为止未见相关文献报导。
　　鸡血藤是沿用千年的活血化瘀中药，古代多篇本草论著中记载鸡血藤具“去瘀血，生新血”的功效。现代常单用或以鸡血藤为主组方治疗如放化疗、血液系统疾病引起的红细胞、白细胞、血小板等的降低。
　　鸡血藤总黄酮(Caulis Spatholobi Total Flavonoids，CSTF)是从鸡血藤的藤茎中提取出的有效活性成分，具有补血活血、抗炎、抗肿瘤等作用。研究报道鸡血藤总黄酮可以促进小鼠红细胞的增殖，治疗各种原因引起的贫血。然而关于鸡血藤对小鼠红细胞成熟分化，尤其是脱核方面的研究和作用机制尚未明确。
　　本实验选用红细胞为研究对象，拟研究Rac1的表达在红细胞脱核中的意义;研究shlnc-EC6与miR-451是否可以通过Rac1通路对红细胞的脱核产生影响;研究在红细胞脱核过程中shlnc-EC6与miR-451相互作用的关系;研究中药鸡血藤总黄酮(CSTF)对红细胞脱核中的促进作用，并探讨其机制是否与Rac1通路有关等。研究内容分为四部分:
　　第一部分 shlnc-EC6对鼠红细胞脱核的影响及机制研究
　　目的:依据长链非编码RNA:shlnc-EC6在小鼠有核红细胞和网织红细胞中的表达情况，研究shlnc-EC6对小鼠红细胞脱核的影响，并探讨其机制是否与靶基因Rac1相关。
　　方法:通过流式细胞仪(FCM)分选小鼠骨髓有核红细胞（脱核前）和网织红细胞（脱核后），运用实时荧光定量PCR(q-RTPCR)技术检测长链非编码RNA-shlnc-EC6的表达情况;通过短发夹RNA（short hairpinRNA，shRNA）技术使用shlnc-EC6-shRNA质粒人工制造shlnc-EC6-shRNA逆转录病毒，感染野生型C57BL/6小鼠胚肝的红细胞前体细胞和造血干细胞(FLEPHSCs)，使用流式细胞仪和细胞涂片仪经特殊染色观察对红细胞脱核的影响;通过利用生物信息学信息预测Rac1是shlnc-EC6的靶基因，在293T细胞中运用双荧光素酶报告验证shlnc-EC6对其靶基因Rac1的直接调控作用;通过q-RTPCR和Western blotting方法检测红系MEL细胞和和G1E细胞在shlnc-EC6降低表达后靶基因Rac1mRNA和蛋白水平的表达变化以及Rac1的下游基因PIP5K的mRNA和蛋白水平的表达变化，进一步确定shlnc-EC6对Rac1和PIP5K的调控作用。在被shlnc-EC6-shRNA逆病毒感染的的FLEPHSCs中，再敲低Rac1的表达使其恢复到正常的Rac1水平，藉以观察红细胞的脱核情况，并通过q-RTPCR方法和Western blotting方法检测Rac1和PIP5K的mRNA和蛋白水平的表达变化;进一步阐明shlnc-EC6-Rac1-PIP5K信号通路与红细胞脱核的关系。
　　结果:
　　1、红细胞中的shlnc-EC6在脱核后比在脱核前高表达(p＜0.05)。
　　2、低表达shlnc-EC6的FLEPHSCs细胞与对照组相比脱核细胞数明显下降(p＜0.05)。
　　3、生物学信息提示，小鼠的Rac13'UTR区域与shlnc-EC6具有2处绑定位点，双荧光素酶报告实验表明shlnc-EC6能绑定Rac1基因的3'UTR对其在转录后水平上进行负性调节。
　　4、低表达shlnc-EC6的红细胞株与对照组细胞相比，细胞中Rac1和PIP5K的mRNA水平及蛋白表达水平明显增高(p＜0.05)。
　　5、构建了Rac1-shRNA质粒，并人工制造Rac1-shRNA逆转录病毒且感染进入红系细胞株之后能降低Rac1的表达(p＜0.05)。
　　6、在已经敲低shlnc-EC6的FLEPHSCs细胞中再次敲低Rac1的表达，导致Rac1 and PIP5K的mRNA和蛋白水平下降并增加了实验组脱核细胞的数量(p＜0.05)。
　　结论:低表达shlnc-EC6阻碍了红细胞的的脱核，其机制可能与靶定Rac1基因相关，进一步阐明了Rac1及与其绑定的shlnc-EC6参与了红细胞的成熟过程，可作为新的分子标靶干预红细胞疾病的治疗及预后。
　　第二部分 miR-451通过Rac1通路调节小鼠红细胞脱核
　　目的:根据微小RNA: miR-451在小鼠有核红细胞和网织红细胞中的表达情况，研究miR-451对小鼠红细胞脱核的影响，并探讨其机制是否与靶基因Rac1相关。
　　方法:通过FCM分选出野生型小鼠骨髓有核红细胞（脱核前）和网织红细胞（脱核后）;运用q-RTPCR技术检测miR-451的表达情况;构建的miR-451-MSCV-PIG质粒;饲养和鉴定miR-451敲除鼠（miR-451KO鼠）并与野生型C57BL/6小鼠杂交传代;通过磁珠分选法筛选miR-451KO鼠和对照组胚肝的FLEPHSCs以及在野生型小鼠的FLEPHSCs中过表达miR-451并使其在体外分化发育，结合FCM和细胞涂片仪观察对鼠红细胞脱核的影响;通过利用生物信息学网站TargetScan及miRbase等数据库的查询预测miR-451的靶基因之一为Rac1，在293T细胞中经双荧光素酶报告验证miR-451对其靶基因Rac1的直接靶向调控作用;通过q-RTPCR方法和Western blotting方法检测红系MEL细胞、G1E细胞和FLEPHSCs在miR-451过表达或敲除后靶基因Rac1 mRNA和蛋白水平的表达变化以及Rac1的下游基因PIP5K的mRNA和蛋白水平的表达变化。
　　结果:
　　1、经基因型鉴定明确了miR-451小鼠的三种类型:野生型(WT)、纯合子型(KO)和杂合子型(Het)。
　　2、红细胞中的miR-451在脱核后比在脱核前明显高表达(p＜0.05)。
　　3、相比对照组WT，miR-451KO小鼠的FLEPHSCs细胞中脱核细胞数明显下降(p＜0.05)。
　　4、双荧光素酶报告实验提示Rac1是miR-451的直接靶基因。
　　5、与对照组相比，miR-451KO组的有核红细胞中Rac1和PIP5K的mRNA水平及蛋白表达水平明显上升(p＜0.05)。
　　6、构建的miR-451-MSCV-PIG质粒感染进入红系细胞株后Rac1明显降低(p＜0.05)。
　　7、在WT型小鼠的FLEPHSCs细胞中过表达miR-451，导致Rac1 and PIP5K的mRNA和蛋白水平下降并有红细胞的脱核细胞数比例下降(p＜0.05)。
　　结论:过多或过少表达miR-451均阻碍了红细胞的的脱核，其机制可能与靶定Rac1基因相关，我们认为可能是Rac1高表达时导致肌动蛋白重排紊乱，不能形成合力排出胞核导致脱核障碍，而Rac1低表达时又导致排出胞核动力不足导致脱核障碍，以上结果具体还需今后进一步研究证实。阐明了Rac1及与其绑定的miR-451参与了红细胞的成熟过程，可作为新的分子标靶干预红细胞疾病的治疗及预后。
　　第三部分小鼠红细胞脱核过程中shlnc-EC6和miR-451相互关系的研究
　　目的:研究shlnc-EC6和miR-451在小鼠红细胞脱核过程中相互作用的关系，探讨shlnc-EC6和miR-451是否相互协同来抑制靶基因Rac1的表达。
　　方法:通过qRT-PCR技术检测shlnc-EC6和miR-451的表达的相关性;运用RNA-蛋白质免疫共沉淀技术检测miR-451和shlnc-EC6是否存在于Ago2蛋白免疫复合体中以阐述它们之间有无关联;通过双色荧光原位分子杂交技术（双色FISH）来研究过表达miR-451的MEL细胞中shlnc-EC6和miR-451两种RNA是否有着直接的关系。
　　结果:
　　1、红细胞中的miR-451敲除后shlnc-EC6表达下降(p＜0.05)，而过量表达miR-451后shlnc-EC6表达也上升(p＜0.05)。
　　2、红细胞中的敲低shlnc-EC6表达后miR-451的表达明显下降(p＜0.05)。
　　3、miR-451和shlnc-EC6共同存在于Ago2免疫复合体中，miR-451和shlnc-EC6之间存在直接或间接的关联。
　　4、双色FISH实验提示miR-451和shlnc-EC6重叠在相同的部位，提示它们的RNA存在直接的关联而发挥功能。
　　5、在转录后水平上，miR-451和shlnc-EC6协同调控Rac1和PIP5K信号通路调节红细胞成熟，尤其是脱核。
　　结论:miR-451的表达和shlnc-EC6的表达成正相关，反之亦然，说明他们之间存在着某种正反馈调节通路;在Ago2蛋白免疫复合体中，miR-451和shlnc-EC6之间存在着直接的关联，在转录后水平上共同调控编码基因Rac1以及它的下游基因PIP5K的表达从而改变红细胞成熟尤其是脱核方面的性状，为早日攻克红细胞的脱核机制提供新的理论基础。
　　第四部分鸡血藤总黄酮可能通过Rac1通路促进小鼠红细胞脱核
　　目的:研究鸡血藤总黄酮(CSTF)对小鼠红细胞分化成熟，尤其是脱核方面的影响，并对其机制进行初步探讨。
　　方法:通过磁珠分选法收集miR-451KO小鼠14.5天胚肝细胞中的红细胞前体细胞和造血干细胞(FLEPHSCs);体外在红细胞分化培养液中培养FLEPHSCs;细胞分为对照组、和鸡血藤组（浓度分别为0.5ug/ml，1.0 ug/ml，1.5 ug/ml，2.0 ug/ml，2.5 ug/ml）;CSTF处理FLEPHSCs一天后使用细胞凋亡试剂盒通过FCM观察细胞凋亡和坏死率的改变;结合FCM和细胞涂片仪W-G染色后观察对miR-451KO小鼠红细胞脱核的影响;鸡血藤治疗后通过q-RTPCR方法检测shlnc-EC6、Rac1 mRNA的表达变化以及通过Western blotting方法检测Rac1蛋白水平的表达变化。
　　结果:鸡血藤总黄酮对miR-451KO的红细胞FLEPHSCs脱核具有促进作用，且有浓度和时间依赖性;治疗量的CSTF组与对照组相比，有核红细胞数下降而脱核细胞数升高(P＜0.05);细胞凋亡率随着CSTF浓度的增加而逐步增高;其中2.0 ug/ml，2.5 ug/ml的CSTF可明显促进细胞凋亡和坏死（P＜0.01）。在miR-451KO的FLEPHSCs细胞中CSTF能够呈浓度依赖性的下调Rac1 mRNA和蛋白的表达水平，能促进长链非编码shlnc-EC6的表达水平。
　　结论:鸡血藤对miR-451KO小鼠红细胞的脱核有促进作用，其机制可能与Rac1信号通路有关，为中医药治疗红系疾病导致的有核红细胞增生性贫血提供了新的理论依据。
　　综上，shlnc-EC6的下调抑制了红细胞脱核，提示其参加了红细胞的脱核过程;Rac1是shlnc-EC6和miR-451的直接靶基因，shlnc-EC6和miR-451通过靶定Rac1调节红细胞脱核;shlnc-EC6和miR-451协同促进作用调控Rac1的表达，从而影响红细胞的脱核过程;鸡血藤总黄酮可能通过shlnc-EC6/Rac1通路促进miR-451KO的FLEPHSCs细胞脱核。本研究探讨了shlnc-EC6/miR-451/Rac1信号通路对红细胞脱核的影响，为红细胞疾病的诊断和治疗提供新的分子标靶，并试图结合中药干预治疗为中西医结合治疗红细胞疾病提供新的科学理论基础。

目录

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一部分 shlnc-EC6对鼠红细胞脱核的影响及机制研究

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 miR-451通过Rac1通路调节小鼠红细胞脱核

1 实验材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 在小鼠红细胞脱核过程中shinc-EC6和miR-451相互关系的研究

1 实验材料和方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第四部分 鸡血藤总黄酮可能通过Rac1通路促进小鼠红细胞脱核的机制研究

1 实验材料和方法

2．结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 红细胞脱核的分子机制研究进展

致谢

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