ELP融合犬β干扰素的表达、纯化、抗病毒活性及体外半衰期研究

摘要

尽管犬疫苗接种较为普遍，但由于疫苗质量、使用方法和病毒变异等原因，犬细小病毒病、犬瘟热、犬病毒性肝炎等传染病流行仍较普遍。Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）是具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用的细胞因子，其中犬重组α干扰素(CaIFN-α)广泛用于犬病毒病的治疗，并取得良好的治疗效果。但现有的犬重组α干扰素多为组氨酸标签融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达，需要经过变性、复性和亲和层析法纯化，不仅价格较高，而且体内半衰期较短。延长干扰素体内半衰期的主要策略有聚乙二醇化和与血清白蛋白等进行融合表达，前者的反应条件和产品质量较难控制，后者仍需亲和层析等方法纯化。类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)是一类根据体内弹性蛋白重复序列合成的五肽聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，可用离心等简单方法分离纯化，因此ELP已被用作重组蛋白的纯化标签。另外，ELP还被用作体内药物传送载体，以起到缓释和延长半衰期作用。
　　犬β干扰素(CaIFN-β)与CaIFN-α具有类似的抗病毒作用，但目前尚无基因工程产品上市。本研究用PCR扩增CaIFN-β成熟肽编码序列，分别将其插入原核表达载体pET-30a和ELP融合表达载体pET-ELP，获得重组载体pET-CaIFNβ和pCaIFNβ-ELP。分别将重组载体转化BL21(DE3)大肠杆菌，在不同温度下用IPTG诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示:在37℃条件下His-CaIFNβ和CaIFNβ-ELP融合蛋白均获得正确表达，但表达产物均为不可溶性包涵体。为了获得可溶性表达产物，对两种融合蛋白的诱导表达温度进行了优化，SDS-PAGE分析结果显示:CaIFNβ-ELP融合蛋白在低于30℃条件下主要以可溶性蛋白表达，而His-CaIFNβ融合蛋白即使在20℃条件下仍以不溶性包涵体表达，表明ELP可增加CaIFN-β的可溶性。在次基础上对IPTG诱导CaIFNβ-ELP融合蛋白表达的浓度和时间进行了优化，结果显示:在20℃条件下，0.1～1.0 mM IPTG均能诱导CaIFNβ-ELP融合蛋白表达，其中0.2 mM IPTG诱导表达产物的量较多，但差异不显著;在6～24h时间内，CaIFNβ-ELP融合蛋白表达量随诱导时间的延长呈上升趋势，诱导18h的表达量最高。这些研究结果为两种融合蛋白的纯化及抗病毒活性研究打下基础。
　　分别在优化条件下进行His-CaIFNβ和CaIFNβ-ELP融合蛋白诱导表达。His-CaIFNβ融合蛋白经过变性、复性后进行镍亲和柱层析纯化，结果显示:融合蛋白纯度为85％，产量为50 mg/L细菌培养。CaIFNβ-ELP融合蛋白用相变循环(ITC)纯化，并对相变温度、氯化钠浓度和离心力等参数进行了优化，结果显示:CaIFNβ-ELP融合蛋白的相变温度为28℃，氯化钠浓度为2.0 mol/L，适宜离心力为12000 g。用优化ITC条件进行CaIFNβ-ELP融合蛋白纯化，纯化产物用4 mol/L尿素溶解，透析后进行SDS-PAGE分析，结果显示:CaIFNβ-ELP融合蛋白的纯度达96％，产量可达220 mg/L。以MDCK细胞/水泡性口炎病毒系统进行干扰素活性检测，结果显示:His-CaIFNβ融合蛋白的抗病毒效价为104 U/mg，CaIFNβ-ELP融合蛋白的抗病毒效价为105 U/mg。血清稳定性检测结果显示，CaIFNβ-ELP融合蛋白的体外半衰期大于24h，显著高于His-CaIFNβ融合蛋白的12h。这些研究结果表明，ELP是有效的CaIFN-β表达和纯化标签，纯化的CaIFNβ-ELP融合蛋白具有较高的抗病毒活性和较长的体外半衰期，有望用于犬病毒病的临床治疗。

目录

摘要

符号说明

综述一：犬干扰素研究进展

1 干扰素概述

2 犬干扰素的作用及应用

3 干扰素的制备

4 长效干扰素研究

5 结语

综述二：类弹性蛋白多肽及其在重组蛋白纯化中的应用

1．综述

2．在重组蛋白纯化中的应用

研究内容一：不同标签融合犬β干扰素的表达及条件优化

1．材料与方法

1．1 主要试剂

1．2 载体与菌株

1．3 溶液与培养基

1．4 实验设备

1．5 目的基因PCR扩增

1．6 PCR产物纯化

1．7 目的片段与T载体连接

1．8 感受态细胞制备

1．9 连接产物转化

1．10 重组子鉴定

1．11 表达载体构建

1．12 融合蛋白表达

2．结果

2．1 目的基因PCR扩增

2．2 表达载体鉴定

2．3 融合干扰素表达分析

2．4 诱导表达温度优化

2．5 可溶性蛋白表达分析

2．6 IPTG浓度和诱导时间优化

3．讨论

研究内容二：融合犬β干扰素的分离纯化及抗病毒活性和体外半衰期比较

1．材料与方法

1．1 试剂与耗材

1．2 主要溶液

1．3 主要仪器设备

1．4 His-CaIFNβ纯化

1．5 CaIFNβ-ELP纯化

1．6 干扰素活性检测

1．7 干扰素血浆稳定性检测

2．结果

2．1 His-CaIFNβ纯化

2．2 CaIFNβ-ELP纯化

2．3 VSV滴度测定

2．4 融合干扰素活性测定

2．5 间接免疫荧光

2．6 干扰素血浆稳定性

3．讨论

参考文献

致谢

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