表达犬γ干扰素重组乳酸球菌的构建及体外抗病毒活性检测

摘要

γ干扰素(IFN-γ)也称为免疫干扰素，主要由活化T细胞、NK细胞产生，具有抑制病毒复制，抗肿瘤，抗寄生虫及免疫调节等作用，随着养犬业的发展，犬的种类和数量增多，疾病尤其是病毒病危害犬的健康与生存，因此作为一种重要的免疫增强剂，犬γ干扰素(CaIFN-γ)作为病毒性疾病的预防、免疫治疗及疫苗佐剂方面具有很好的应用前景。
　　 为获得抗CaIFN-γ蛋白的兔血清抗体，本实验将CaIFN-γ基因通过EcoR I、SalI酶切位点与表达载体pET30a连接，构建了重组表达质粒pET30a-CaIFN-γ，并转入大肠杆菌，经诱导表达CaIFN-γ蛋白，SDS-PAGE和western blot结果显示，重组蛋白约23 ku并主要以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后肌注家兔，制备出CaIFN-γ的抗血清，测得血清效价为1∶12800。
　　 依据乳酸球菌常用氨基酸密码子的偏嗜性，对CaIFN-γ基因进行了优化并合成。以乳酸乳球菌pH诱导分泌型质粒pAMJ399作为表达载体，构建了重组质粒pAMJ399-CaIFN-γ，并电转化至乳酸乳球菌PSM565中，构建重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565，通过自身产酸启动诱导。SDS-PAGE结果表明，菌体中可见约20ku的目的蛋白;Western blot检测结果显示，在培养上清和菌体中都可见与兔抗CaIFN-γ抗体特异性发生反应的约20ku的目的蛋白，可见CaIFN-γ蛋白在重组乳酸乳球菌中获得了表达，重组蛋白既可以以分泌上清的形式存在于培养液中，同时在菌体内也存在表达的蛋白。
　　 为提高重组乳酸菌的表达量，通过对生长曲线及pH对生长曲线的影响确定发酵罐发酵的条件，结果表明32℃，搅拌速度50rpm，6h后以0.5s/min速率补充50％葡萄糖可提高重组乳酸菌的活菌数，其中pH维持在5.5和5.75时，培养上清中的表达量分别约为460ng/ml和400ng/ml要多于pH在6和6.25的表达量。
　　 为检测重组乳酸乳球菌表达CaIFN-γ的抗病毒活性，将重组菌诱导的菌液上清，过滤除菌后通过倍比稀释与MDCK细胞共孵育24h，接种水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)进行攻毒检测CaIFN-γ的抗病毒活性，30h后显微镜下观察细胞病变情况，可见与CaIFN-γ共孵育组的细胞生长状况良好，而未添加CaIFN-γ的对照组细胞发生明显病变，细胞圆缩、聚集、脱落;通过MTT法检测统计分析结果可见，5倍浓缩上清的CaIFN-组相比病毒组差异极显著(P＜0.01)，可见重组乳酸乳球菌分泌的CaIFN-γ上清具有良好的抗病毒活性;应用SYBR Green实时定量PCR方法测定干扰素作用后的MDCK细胞攻毒之后的病毒感染量，可见重组菌组pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565与空载体组pAMJ399/PSM565和病毒组的ACt值相比较差异均显著(P＜0.01)，表明重组菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565分泌上清5倍浓缩作用的MDCK细胞攻毒后的病毒载量明显低于病毒组，即重组菌表达的犬γ干扰素起到了明显的抗病毒作用。以上结果表明，本实验获得的重组乳酸乳球菌表达的犬γ干扰素为临床上的抗病毒应用和作为细胞因子佐剂的研究奠定了坚实的基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 干扰素的研究概述

1．1．1 γ干扰素的发现

1．1．2 干扰素的理化性质

1．2 γ干扰素受体及其介导的信号传导机制

1．2．1 γ干扰素受体

1．2．2 γ干扰素的信号传导机制

1．2．3 不依赖STAT的γ干扰素信号传导途径

1．2．4 干扰素信号传导的抑制调节

1．3 干扰素的生物学特性及作用机理

1．3．1 干扰素抗病毒活性及其机理

1．3．2 干扰素的免疫调节活性

1．3．3 干扰素的抗肿瘤活性

1．4 γ干扰素的应用及发展前景

1．5 乳酸乳球菌作为宿主菌表达外源蛋白的研究进展

1．5．1 乳酸乳球菌的益生作用

1．5．2 乳酸乳球菌作为表达载体宿主菌的优越性

1．5．3 乳酸乳球菌作为表达载体的应用

1．6 研究的目的和意义

2 材料及方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和载体

2．1．2 病毒和细胞

2．1．3 实验动物

2．1．4 引物设计与基因合成

2．1．5 主要试剂

2．1．6 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 表达CaIFN-γ重组大肠杆菌的构建

2．2．2 CaIFN-γ在重组大肠杆菌中的诱导表达

2．2．3 多克隆抗血清的制备

2．2．4 表达犬γ干扰素重组乳酸乳球菌的构建

2．2．5 重组乳酸乳球菌的诱导表达及鉴定

2．2．6 重组乳酸乳球菌发酵条件优化

2．2．7 犬γ干扰素抗病毒活性检测

3 实验结果

3．1 重组表达质粒pET30a-caIFN-γ的鉴定结果

3．2 重组大肠杆菌表达蛋白的诱导及鉴定

3．2．1 重组大肠杆菌诱导后不同时间的蛋白表达

3．2．2 重组蛋白CaIFN-γ的表达形式分析

3．2．3 重组大肠杆菌表达产物westen blot鉴定结果

3．3 间接ELISA检测免疫兔血清抗体效价结果

3．4 重组乳酸乳球菌表达系统的构建

3．4．1 重组质粒pAMJ399-CaIFN-γ的鉴定

3．4．2 重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ／PSM565的鉴定

3．5 重组乳酸乳球菌表达CaIFN-γ蛋白的鉴定

3．5．1 重组乳酸乳球菌SDS-PAGE结果

3．5．2 重组乳酸乳球菌Western-blot结果

3．6 发酵条件的优化

3．6．1 重组菌生长曲线及pH值的测定

3．6．2 β甘油磷酸二钠对重组菌生长情况的影响

3．6．3 发酵条件的优化

3．7 犬γ干扰素抗病毒活性的检测

3．7．1 干扰素细胞毒性实验

3．7．2 干扰素抗病毒活性

3．7．3 MTT法检测干扰素抗病毒活性结果

3．7．4 MDCK细胞攻毒后病毒载量的检测结果

4 讨论

4．1 构建重组乳酸乳球菌表达系统的立足点

4．2 重组乳酸乳球菌表达蛋白效果分析

4．3 重组犬γ干扰素抗病毒活性及检测方法分析

4．4 重组乳酸乳球菌发酵与发酵技术分析

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文