南京地区日本血吸虫病的流行病学调查及其基于血清差异多肽检测方法的建立与应用

摘要

血吸虫病是对人与动物危害最严重的寄生虫病之一，是世界卫生组织认定的分布范围最广、经水传播疾病(Water-borne diseases)感染率最高的寄生虫病。至2015年底，江苏省除南京市四个区县（栖霞、六合、浦口、江宁）与镇江市3个区县（丹徒、扬中、润州）尚处于血吸虫病控制阶段，其余各市（县、区）均已达血吸虫病传播阻断标准。然而，长江中上游部分省市仍然处于疫情控制阶段，其阳性钉螺与感染病人病畜仍时有发现，部分达标地区存在钉螺复燃情况，且钉螺（Oncomelania hupensis）可随水系扩散与人群流动频繁等因素，对江苏血防构成较大的威胁。因此，对当前低流行态势下的重点区域血吸虫病流行情况做一全面调查，对血防策略的调整具有重要意义。
　　血防监测包括对血吸虫中间宿主（钉螺）分布、终宿主（人与易感动物）的流行病学调查、应用“哨鼠”开展早期预警、晚期血吸虫病人的诊断与治疗。在当前低流行态势下，以抗体ELISA检测、粪便查虫卵为主的方法，已满足不了早期监测的要求，亟需发展快速、准确的检测新方法;寄生虫学剖检查成虫的哨鼠检测方法也存在时效性差、耗时耗力、准确性不高等缺点，迫切需要发展更为准确、快速、灵敏的方法;再者，针对新发展晚血病人与现症病人的鉴别，在血吸虫病低流行态势下，需建立新的辅助诊断方法。
　　本研究在南京地区开展了血吸虫病流行病学调查，并基于血清差异多肽建立诊断新方法以及应用于实验小鼠、预警“哨鼠”及晚血与现症病人的鉴别诊断。
　　1.钉螺及其感染尾蚴与人畜感染日本血吸虫抽样调查
　　2013-2014年在栖霞区、2015年在高淳区的芜申运河水阳江段开展了钉螺密度与人畜感染情况调查。
　　方法:根据《血吸虫病控制与消除标准GB15976-2015》，机环结合法开展钉螺调查，DDIA血清学与尼龙绢袋集卵孵化粪检法开展人群调查，塑料杯顶管粪便孵化法检测动物血吸虫感染;并结合往年报表数据分析。
　　结果:栖霞区与高淳区的水阳江段均未查到阳性钉螺;但水阳江段活螺密度显著高于其他地区，提示水阳江段具备血吸虫病传播风险。人群调查显示，栖霞区2个行政村的血清学检查阳性率均低于1％，高淳区3个行政村血检阳性率2.48％，粪检均未查出阳性。家畜粪检未检测到感染。
　　结论:综合2004-2014江苏省血吸虫病防治工作报表分析，江苏省内有螺面积逐年减少，活螺数与活螺密度维持在相对稳定的较低水平;血吸虫病呈低度流行态势，近年无血吸虫急性感染病例报道;高淳区水阳江段血检阳性率高于1％的血吸虫病传播控制标准，也高于全省其他地区的血清阳性率，提示该地区具有较高风险，需加强疫情监测。
　　2.实验兔血清肽谱分析及基于血清差异多肽检测法的建立
　　分析血吸虫急性感染实验兔的血清肽质量指纹图谱，并根据血清差异多肽建立诊断方法。
　　方法:通过血清采集、磁珠富集血清多肽、MALDI-TOF/TOF质谱检测与ClinProTools分析血清肽质量指纹图谱，建立人工感染兔的血清差异多肽诊断方法（CPT方法），并进行敏感性与特异性分析，比较多种方法检测不同感染时期的准确性。
　　结果:Mr1787蛋白分子在兔感染后第6d有显著上调（P＜0.05）;在感染后第9d，Mr2834蛋白分子有极显著上调(P＜0.01)，Mr3483呈显著上调(P＜0.05)，Mr4018有显著下调（P＜0.05）。在感染后第12d，Mr3151蛋白分子有显著下调(P＜0.05)，而Mr4018则出现极显著下调(P＜0.01)，Mr3530呈显著上调（P＜0.05），两者趋势一直持续至感染后第30d。经二级质谱鉴定并搜库比对，预测Mr1787蛋白为α烯醇化酶的片段，Mr3530预测为热休克蛋白90或热休克蛋白47片段，提示此两种蛋白可能为血吸虫感染兔的早期疾病标志物。基于感染第5周与健康对照组血清差异多肽指纹图谱，利用ClinProTools软件建立感染组与健康对照组的区别诊断模型，盲测样本显示，感染1、2、3、4w的家兔血清鉴定为阳性的占30％、55％、75％、80％，而同期ELISA检测结果分别为0，0，20％和50％，利用弓形虫感染血清验证，结果显示特异性好。
　　结论:基于血清差异表达多肽建立的诊断方法，敏感性要优于常规的ELISA法，有望应用于血吸虫病早期检测并筛选具有诊断价值的血清多肽（蛋白）标志物。
　　3.血清多肽检测方法的应用
　　3.1血清差异多肽检测法在实验小鼠模型上的应用
　　小鼠动物模型在血吸虫感染实验及相关研究中应用广泛，发展对其快速、准确、简便的诊断方法意义重大。
　　方法:采用血清富集并磁珠纯化多肽、MALDI-TOF/TOF质谱检测与ClinProTools分析肽质量指纹图谱，根据急性感染第5 w与健康对照组血清差异表达多肽，建立检测方法（CPT方法），并比较ELISA、寄生虫学剖检等多种方法的检测敏感性，并验证急性感染不同时期、不同感染度小鼠的准确性。
　　结果:与传统的ELISA方法比较，CPT方法在第1w即检测到急性感染小鼠5％(3/60)的阳性率，在第2w至第5w呈逐渐上升趋势，分别为35％(21/60)，75％(45/60)，87.93％(51/58)与98.15％(53/54)，而ELISA方法在感染后第3w才检测到阳性，其3-5 w的感染率分别为65％(39/60)，77.59％(45/58)与94.44％(51/54)，均低于CPT方法;寄生虫学剖检在第3、4w有70％(7/10)的小鼠被检出阳性，低于CPT方法同期检出率。针对不同感染度小鼠的诊断，在感染14，18，22条尾蚴的小鼠中，所有小鼠均被预测为感染，准确性达100％，感染4、6、10条尾蚴组的小鼠预测准确率分别为40％(4/10)，50％(5/10)与80％(8/10)。
　　结论:血清差异多肽检测法较血清抗体ELISA检测法至少提前2-3 w，较寄生虫学剖检极大的降低了工作量，可以用于低度感染状态下的实验小鼠检测和样本初筛，有望为“哨鼠”检测提供新的方法。
　　3.2血清差异多肽检测法在血防“哨鼠”预警上的应用
　　利用“哨鼠”监测长江水体血吸虫感染风险，是我省血防预警工作的重要手段，寄生虫学剖检查成虫与肝脏虫卵结节是判断“哨鼠”感染与否的主要手段，但时效性较差，且耗时耗力，需要发展新的快速检测方法。
　　方法:剖检2015年现场试验的660只哨鼠（含栖霞与高淳60只、宁镇扬600只）并采集血清、5例本室保存的经解剖查成虫确诊的阳性“哨鼠”与50例阴性“哨鼠”血清，经血清多肽富集与质谱检测，获取多肽指纹图谱，并导入已建立的血清多肽检测方法（CPT法）验证。
　　结果:5例阳性“哨鼠”与50例阴性“哨鼠”均可以被准确诊断，2015年现场试验的660只哨鼠经CPT验证为未感染，与寄生虫学剖检结果一致。
　　结论:利用血清差异表达多肽检测方法，较常规“哨鼠”解剖查成虫方法，节省人力物力，并可以提早1-2w对“哨鼠”进行初筛，缩短了检测血吸虫感染的“窗口期”，可与常规病原学检测方法联合应用于“哨鼠”早期预警。
　　3.3血清差异多肽检测法在鉴别晚血病人上的应用
　　晚期血吸虫病人的诊断及治疗是血防工作重点，尤其在低流行态势下，对血吸虫病地方考核更为重要。病原学检查与抗体检测，很难区别现症与既往病人。
　　方法:采集晚血、新发展晚血、晚血治愈、健康对照四组人群，血清多肽指纹图谱检测并应用ClinProTools分析，建立基于新发晚血组与健康对照组血清差异多肽的检测方法。
　　结果:晚血与新发晚血、新发晚血组中切脾与否在血清肽谱无显著差异。与健康对照组相比，晚血组在Mr2662，2991，3241，5337与5906处均显著下调，在Mr2082与4282处均显著上调;而有史治愈组与健康对照组比较发现，在Mr2662，4209，5337与5906处显著下调，2082处显著上调。新发晚血组与有史对照组相比，在Mr3241处显著下调。提示Mr3241显著下调、4282显著上调可以作为判定新发晚血的指征，二级质谱鉴定并搜库，推测该两种多肽（蛋白）均为免疫球蛋白重链可变区。根据新发晚血组与健康对照组的差异表达多肽建立的诊断方法，盲测试验显示，晚血组、有史治愈组、无血吸虫感染组均与晚血病人具有一致的血清肽谱特征，而粪检阳性病人血清有73.3％(11/15)无法被验证，不能归于新发晚血或健康对照组，水阳江段流行病学调查获取的血清抗体阳性但粪检阴性样本有86.2％(25/29)被验证为晚血组。
　　结论:血清差异多肽检测法可以间接将晚血病例与现症病例区分，但后者可能包括既往感染或反复感染，故有部分仍然被验证为晚血组，提示感染者有进一步发展为晚血病人的可能;水阳江段流行病学调查人群可能为既往感染，非现症病人;血清差异多肽检测联合常规寄生虫学检查，可以对血吸虫流行病学调查进行初筛。

目录

摘要

符号说明

前言

第一章 血吸虫病研究概况与防治技术进展

1 血吸虫与钉螺

1．1 血吸虫的发现及其病原学

1．2 血吸虫生活史

1．3 血吸虫病分布流行

1．4 血吸虫传播流行的中间宿主

2 血吸虫病防治技术

2．1 血吸虫病诊断与预警

2．2 血吸虫病治疗研究进展

2．3 我国血吸虫病防治现状与进展

参考文献

第二章 南京地区钉螺及其尾蚴感染的抽样调查

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 南京地区人与家畜感染日本血吸虫的抽样调查

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章 基于血清差异多肽检测日本血吸虫病方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第五章 血清差异多肽检测法在实验小鼠模型的应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第六章 血清差异多肽检测法在血防“哨鼠”预警上的应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第七章 血清差异多肽检测法在鉴别晚血病人上的应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

总结

附表

致谢

攻读学位期间发表的学术论文、申请专利及专著

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