N-酰基高丝氨酸内酯酶AidE的初步晶体学研究

摘要

在一些革兰氏阴性病原菌如绿脓假单胞菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中，毒力因子产生、生物膜形成、生物发光、抗生素合成、粘附、群游现象、孢子形成等行为与群体感应系统有着密切的联系。群体感应参与微生物分泌特定分子如自体诱导剂来调节种内和种间密度。介导细胞间通路的小分子的结构是多样的，其中一大类信号分子由Ⅳ-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)组成。群体感应系统以可扩散的N-酰基高丝氨酸内酯作为细胞间信号传递分子，AHL的浓度在调节病原细菌的毒力基因表达和相关重要生物功能上发挥着关键作用。一些生物含有编码AHL内酯酶的基因，编码的内酯酶可破坏AHLs的内酯环，从而阻断群体感应系统。
　　AidE是一种来源于苍白杆菌属的AHL内酯酶，目前没有关于AidE结构与功能方面的报道。本研究运用分子生物学技术构建AidE重组蛋白，过表达、运用Ni亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析进行蛋白样品的纯化和制各，获得电荷均一、分子量大小以及聚体形式均一的AidE蛋白。进一步通过优化Ni亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析的纯化步骤，获得两相均一的硒代AidE蛋白。AidE是一种对AHL酰胺链长度和C3位取代基具有底物宽泛性的锌离子依赖型AHL内酯酶。一级序列比对分析表明，AidE与其它已知的AHL内酯酶的同源度小于25％。根据该系统进化树的拓扑结构，AidE属于金属-β-内酰胺酶家族，为金属依赖蛋白，含有金属结合基序“HXHXDH”。运用坐滴法和悬滴法对AidE蛋白进行晶体生长条件的筛选，获得最初微晶生长条件，最终在1.575 M ammoniumsulfate，0.1 M sodium cacodylate trihydrate pH6.6，0.01 M cobalt(Ⅱ) chloride条件下获得了AidE的单晶，并收集衍射数据。运用衍射数据处理软件HKL2000处理得到AidE初步晶体学数据。AidE蛋白晶体属于正交晶系，空间群为P2221。在其结构解析的过程中，由于AidE晶胞的一个不对称单位里存在10个分子，因此不能用分子置换法进行求解，而必须用实验相角（重原子浸泡法或硒代）的方法进一步获得正确的结构。目前已获得硒代AidE蛋白微晶的生长条件，待优化以获得可用于衍射数据收集和结构解析的单晶。

目录

摘要

前言

1 细菌的群体感应系统

2 群体感应系统中的AHL信号分子

3 群体感应系统中AHL降解酶研究进展

3．1 AHL酯酶

3．2 AHL酰胺酶

4 蛋白晶体生长相关原理

5 本研究的目的与意义

材料与方法

1 菌株和质粒

2 培养基与缓冲液配制

3 主要试剂

3．1 分子生物学相关试剂

3．2 蛋白表达与纯化相关试剂

3．3 晶体生长相关试剂

3．4 主要实验耗材

4 主要仪器

5 AidE蛋白的表达

5．1 AidE表达质粒的构建

5．2 AidE蛋白的诱导表达

5．3 AidE蛋白的纯化

5．4 硒代AidE蛋白的纯化

6 AidE的底物特异性研究

7 AidE母体及硒代蛋白晶体生长

7．1 玻片的硅化

7．2 AidE母体晶体生长

7．3 硒代AidE蛋白的晶体生长

7．4 AidE的初步晶体学数据

结果与分析

1 AidE重组蛋白的载体构建及序列分析

1．1 AidE重组蛋白的载体构建

1．2 AidE重组蛋白的序列分析

1．3 AidE的系统发育树构建

2 AidE的表达与纯化

2．1 Ni柱亲和层析纯化

2．2 凝胶过滤层析纯化

3 硒代AidE蛋白的表达与纯化

3．1 Ni柱亲和层析纯化

3．2 凝胶过滤层析和QFF离子交换层析

4 AidE功能研究

5 AidE及硒代AidE蛋白晶体的生长

5．1 AidE蛋白晶体的生长

5．2 硒代AidE蛋白晶体的生长

6 AidE晶体衍射数据的收集及初步晶体学数据的统计

讨论

1 重组蛋白的表达与纯化

2 AidE的序列分析及功能研究

3 AidE蛋白与硒代AidE蛋白的结晶

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文

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