三重LAMP检测禽源沙门氏菌、大肠杆菌磺胺耐药基因(sul1、sul2、sul3)研究

摘要

磺胺类药物的长期使用已使多种细菌对其产生了耐药性。大量研究表明，细菌尤其是革兰氏阴性菌对磺胺类药物产生耐药主要是通过获得质粒编码的耐药基因所引起的，目前共发现3种磺胺耐药基因(sul1、 sul2和sul3)。本研究利用环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)技术，建立高效扩增sul1、 sul2和sul3的三个LAMP系统;经过优化，合并三个LAMP系统，成功地建立可以同时扩增三种磺胺耐药基因的三重LAMP方法。该方法可快速、灵敏、特异地检测禽源沙门氏菌和大肠杆菌中三种磺胺耐药基因，为指导临床用药、控制耐药菌株的流行提供重要的技术支撑。
　　一、禽源沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定及其对磺胺异噁唑的敏感性检测
　　对从规模化养禽场、动物疫病诊断部门分离的沙门氏菌（468株）、大肠杆菌（171株）进行纯化、鉴定，并检测其对磺胺异噁唑的敏感性。磺胺耐药表型检测结果发现，耐药菌株有532株，占总数的83.26％。其中沙门氏菌耐药菌株389株，耐药率为83.12％(389/468);大肠杆菌耐药菌株143株，耐药率为83.63％(143/171)。在沙门氏菌耐药菌株中，鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌三种主要流行血清型的耐药率分别为83.61％(255/305)、83.91％(73/87)和84.48％(49/58)。此外，鼠伤寒沙门氏菌、奥尔巴尼沙门氏菌、海德堡沙门氏菌和圣保罗沙门氏菌的耐药率分别为71.43％、66.67％、66.67％和50％。
　　二、三重LAMP检测磺胺耐药基因(sul1、sul2、sul3)方法的建立
　　根据GenBank中提供的三种磺胺耐药基因序列，基于sul1，sul2，sul3基因的保守区域分别设计三组LAMP引物，建立sul1，sul2，su13的LAMP反应体系。确定三种磺胺耐药基因的LAMP最优反应体系，并进行了灵敏度与特异性的验证。
　　在此基础上，探索、优化三重LAMP反应各组分浓度及反应参数等条件，包括优化内外引物比例、Mg2+浓度、Bst DNA polymerase的添加量、dNTPs浓度及反应温度等，并进行了特异性、敏感性等性能的测试，且扩增产物通过限制性内切酶HinfI快速酶切验证。同时，本方法实现了结果判定可视化，通过加入钙黄绿素试剂，根据颜色差异即可在可见光下判定结果。研究结果表明，该检测方法具有良好的特异性和稳定性，检测灵敏度达到0.5 pg/管，优于普通PCR的5 pg/管，且方便快捷，适于现场快速检测。
　　三、禽源沙门氏菌、大肠杆菌临床分离株磺胺耐药基因(sul1、sul2、sul3)的检测
　　应用所建立LAMP方法对禽源沙门氏菌和大肠杆菌菌株进行磺胺耐药基因(sul1、sul2、sul3)的检测。其中522株菌检测结果为阳性，耐药基因检出率为81.69％(522/639)。与耐药表型相比，有497株菌株的LAMP检测结果与药敏试验结果一致，符合率为93.42％(497/532)。
　　在含有磺胺耐药基因的菌株中，沙门氏菌383株，占沙门氏菌菌株总数的81.84％;其中，含sul1基因型有194株，sul2基因型有242株，sul3基因型有23株。大肠杆菌139株，占大肠杆菌总菌株数的81.29％(139/171);其中，sul1基因型阳性菌101株，sul2基因型阳性121株，sul3基因型阳性17株。从耐药基因分布来看，sul2基因在大肠杆菌和沙门氏菌7个血清型中均有存在，而圣保罗沙门氏菌外的其他各血清型细菌均检测到sul1基因。鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和印第安纳沙门氏菌三种主要流行血清型均含有三种耐药基因，而圣保罗沙门氏菌仅检测到sul2基因型。从耐药基因阳性率看出，大肠杆菌及沙门氏菌各血清型的sul2阳性率(363/522;69.54％)均高于sul1(295/522;56.51％)，sul3的阳性率则非常低(40/522;7.66％)。含1种sul基因的菌株共有172株，占阳性株总数的32.95％;含2种sul基因的菌株共有322株，占阳性株总数的61.69％;含3种sul基因的菌株共有28株，占阳性株总数的5.36％。可见，目前含有磺胺耐药基因的菌株，主要是由sul1和sul2基因所介导。
　　综上所述，本研究利用LAMP技术快速、简便、特异、灵敏的优点，建立了一种三重LAMP检测磺胺耐药基因的方法。三种磺胺耐药基因的LAMP扩增产物均可通过限制性内切酶HinfI快速酶切验证。同时，本方法实现了结果判定可视化，通过加入钙黄绿素试剂，根据颜色差异即可在可见光下判定结果。本研究检测方法不仅适用于临床分离菌株的磺胺耐药基因（sul1、sul2、sul3）的检测，以合理、科学地指导用药，而且对于探究细菌耐药基因与耐药表型间的关系提供了一种重要的检测方法，这对于进一步研究病原菌磺胺耐药机制及其演变也具有重要意义。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 磺胺类药物的性质及其抗菌机理

2 细菌对磺胺类药物的耐药机制

2．1 遗传基因DNA改变介导的耐药性

2．2 可移动基因元件及其转移产生的耐药性

3 细菌对磺胺类药的耐药现状

4 细菌耐药性检测方法的研究进展

4．1 药敏试验

4．2 聚合酶链式反应技术

4．3 飞行时间质谱技术

4．4 基因芯片技术

4．5 全基因组测序

4．6 微流控芯片

5 环介导等温扩增技术(LAMP)及其应用研究进展

5．1 环介导等温扩增技术

5．2 LAMP技术在病原微生物快速诊断中的应用

第二章 禽源沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定及其对磺胺异噁唑的耐药性检测

1 材料

1．1 样品采集

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 禽源沙门氏菌和大肠杆菌的鉴定

2．2 对磺胺异噁唑敏感性的检测

3 结果

3．1 禽源沙门氏菌与大肠杆菌的分离鉴定

3．2 细菌对磺胺异噁唑的敏感性试验结果

4 讨论

第三章 三重LAMP检测磺胺耐药基因(sul1、sul2、sul3)方法的建立

1 材料

1．1 菌株

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 细菌模板DNA的制备

2．2 LAMP反应引物的设计

2．3 磺胺耐药基因三重LAMP反应方法的建立

2．4 三重LAMP反应体系的优化

2．5 特异性试验

2．6 敏感性试验

3 结果

3．1 细菌模板DNA的制备

3．2 三重LAMP反应引物的设计、筛选结果

3．3 三重LAMP反应体系的建立

3．4 三重LAMP反应体系的优化结果

3．5 特异性试验结果

3．6 敏感性试验结果

4 讨论

第四章 禽源沙门氏菌、大肠杆菌临床分离株磺胺耐药基因(sul1、sul2、sul3)的检测

1 材料

1．1 菌株

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 对菌株样本进行三重LAMP检测

2．2 阳性菌株中三种磺胺耐药基因的检测

3 结果

3．1 本研究LAMP方法对菌株样本磺胺类药物耐药基因检测结果

4 讨论

参考文献

全文小结

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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