利用可控表达转基因小鼠模型研究MSTN对肌肉生长发育的影响

摘要

MSTN是肌肉生长发育的一个重要的负调控因子，是影响体型发育的经典基因之一，其表达量的增加与肌肉量的减少密切相关，抑制MSTN基因的功能，动物会呈现出双肌表型，这对畜牧生产、动物遗传育种、肌肉萎缩性疾病的诊断、治疗和预后等方面具有重要意义，但MSTN是一个在胚胎早期就能表达的基因，胚胎期沉默或敲除MSTN基因会因肌肉过度肥大而造成难产、流产、死胎。实现MSTN基因的可控表达成为发挥MSTN基因应用价值的关键。本研究通过设计MSTN shRNA并验证其基因沉默效率，构建可控表达MSTN shRNA载体，制备高效可诱导MSTN shRNA表达的转基因小鼠模型，利用可控表达转基因小鼠模型研究MSTN对肌肉生长发育的影响，为将可控表达的MSTN基因应用到基因工程育种、药物治疗肌肉萎缩病等方面奠定技术基础，提供有价值的参考。主要研究内容和结果如下:
　　研究一:小鼠MSTN shRNA过表达载体构建及基因沉默效率检测
　　本研究根据小鼠MSTN mRNA序列设计了4对shRNA序列，构建相应的MSTN shRNA过表达载体pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA，利用QRT-PCR、Western blot技术检测shRNA干扰后细胞内MSTN mRNA及蛋白表达水平。结果表明，本研究设计并构建的4个MSTNshRNA过表达载体，在细胞水平都能有效降低MSTN mRNA及蛋白的表达水平，其中转染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714载体细胞组基因沉默效率最高，MSTN mRNA和蛋白表达分别下降72％、74％，差异极显著(P＜0.01)。
　　研究二:小鼠MSTN shRNA可控表达载体构建及诱导效率检测
　　选取干扰效率最好的shRNA MSTN714构建可控表达载体ptTS-MSTN shRNA，重组载体转染小鼠成肌细胞经G418筛选富集整合有外源载体的细胞，通过强力霉素诱导细胞中MSTN shRNA表达，利用细胞免疫荧光观察细胞内绿色荧光蛋白，利用QRT-PCR、Western blot技术检测MSTN mRNA及蛋白的表达水平检测诱导效率。结果表明，tTS-MSTNshRNA组细胞和Control组细胞在不添加DOX时，仅检测到少量绿色荧光表达，添加DOX后，GFP蛋白信号显著增强;经DOX诱导后，转染含MSTN shRNA重组载体细胞组MSTNmRNA相对表达水平比未经DOX诱导组及其他对照组细胞中降低70％左右，差异极显著(P＜0.01)，MSTN蛋白也下降90％左右，其他各组间MSTN mRNA及蛋白表达量差异不显著(P＞0.05)。
　　研究三:可控表达MSTN shRNA转基因小鼠的制备及对小鼠生长发育的评价
　　将tTS-MSTN shRNA载体线性化后，利用显微注射法制备MSTN shRNA可控表达转基因小鼠。利用PCR技术对获得的F0代转基因小鼠进行整合检测，利用QRT-PCR方法检测转基因小鼠体内外源基因tTS的表达。检测结果表明，制备的159只F0代小鼠中得到8只阳性小鼠。
　　选取tTS表达效率最好的转基因小鼠扩繁的后代进行转基因小鼠MSTN shRNA诱导活性、生长状况、繁殖性能、肌肉组织学等进行检测评价。结果表明，经DOX诱导的Tg+DOX组小鼠体重显著低于Tg、 WT+DOX、WT组小鼠;所制备的转基因小鼠，DOX诱导前的产仔数（7±0.63&7.2±0.84）和窝存活仔数（6.2±0.75&6.4±0.55）均与同期饲养的正常小鼠(WT)差异不显著(P＞0.05);与未经诱导的MSTN转基因小鼠及正常小鼠相比，加DOX诱导之后的MSTN转基因小鼠肌纤维数目增多、肌纤维横截面积增大。

目录

摘要

符号说明

文献综述

1．MSTN的研究进展

2．shRNA可控表达系统

3．研究的目的和意义

参考文献

研究一 小鼠MSTN shRNA过表达载体构建及基因沉默效率检测

1．材料与方法

2．实验结果

3．讨论

研究二 小鼠MSTN shRNA可控表达载体构建及诱导效率检测

1．材料与方法

2．实验结果

3．讨论

研究三 可控表达MSTN shRNA转基因小鼠的制备及对小鼠生长发育的评价

1．材料与方法

2．实验结果

3．讨论

参考文献

全文结论

致谢

攻读硕士学位期间发表论文

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