芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷对AngⅡ诱导的HUVECs氧化损伤模型作用机制

摘要

本文首先利用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立氧化损伤模型模拟体外高血压细胞损伤模型，其次通过考察细胞形态、细胞活性、微观结构、细胞凋亡以及检测细胞功能中氧化损伤标志物丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力来评价芹菜苷与3-甲氧基芹菜苷的修复效果，进而选取功能活性较强的芹菜苷，再通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)等技术来研明芹菜苷对血压调节的细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)信号通路的影响，从而阐明芹菜苷在血管内皮细胞中发挥修复作用的途径，为芹菜黄酮调节血压研究提供理论基础，同时为高血压病患者日常膳食提供有效的建议。主要的实验结果及结论如下:
　　(1)以HUVECs为模型细胞，AngⅡ为诱导剂，筛选诱导剂的浓度和诱导时间对HUVECs氧化应激损伤的影响。实验发现AngⅡ能明显的诱导内皮细胞的氧化损伤，主要表现为细胞形态变化，细胞器细胞膜结构损伤，细胞活性下降，凋亡率上升，细胞脂质过氧化增加，细胞的分泌功能如NO释放率、eNOS、SOD活力降低。其中1μmol/L AngⅡ诱导12h时各项指标为细胞活性为65.11％，NO含量43.57μmol/L，TNOS活力为6.99U/mgprot，eNOS活力为1.89 U/mgprot，MDA含量为7.46 nmol/mgprot，SOD活力为144.88U/mgprot，细胞凋亡率为(41.5±2.6)％，微观结构显示核膜皱缩，核仁消失，胞浆内出现大量空泡状结构，线粒体或者细小或者肿胀，粗面内质网扩张数目较少，部分核糖体丢失，平面内质网扩张，但细胞未解体，仍然保持细胞结构。
　　(2)以芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷标准品为研究对象，通过与建立损伤模型相同的技术考察两者对模型的修复情况。实验发现两者均可以增加细胞活力，增加NO释放量，清除自由基，减少细胞内过氧化物的产生，降低细胞凋亡率，修复细胞器细胞膜结构等，且上述功能在芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷浓度低于50μmol/L时随时间呈剂量依赖增加关系，高于50μmol/L时修复细胞的功效开始降低。说明两者均具有一定程度的修复损伤的内皮细胞作用。具体结果为:50μmol/L芹菜苷修复12h时，各指标分别为细胞活力79.07％，NO含量为139.22μmol/L，TNOS活力为26.32 U/mgprot，eNOS活力为16.32 U/mgprot，MDA含量为5.47 nmol/mgprot，SOD活力为51.51 U/mgprot，细胞凋亡率下降到(14.7±1.2)％，微观结构显示细胞核仁基本完整，胞浆内空泡减少，粗面内质网及核糖体数目未见减少，形态未见明显病变。50μmol/L3-甲氧基芹菜苷修复12h时，各指标分别为细胞活力64.50％，NO含量为78.88μmol/L，TNOS活力为19.94 U/mgprot，eNOS活力为12.41 U/mgprot，MDA含量为7.93 nmol/mgprot，SOD活力为44.32 U/mgprot，细胞凋亡率下降到(33.7±1.7)％，微观结构显示细胞器数量减少，仍有部分线粒体肿胀。说明3-甲氧基芹菜苷在一定程度上同样具有减缓血压症状的作用，其发挥作用的规律与芹菜苷类似，但效果不如芹菜苷。综合两者的作用效果，最终选择50μmol/L芹菜苷修复12 h来研究芹菜苷对ERK1/2信号通路的作用。
　　(3)ERK1/2信号通路是与高血压相关的信号通路之一。实验发现，在AngⅡ诱导的模型中加入芹菜苷，ERK1、ERK2的mRNA表达分别降低7.84％、22.28％，磷酸化蛋白表达分别降低30.91％、11.33％，说明芹菜苷可以抑制磷酸化ERK1、ERK2的mRNA和蛋白表达来发挥降血压作用。实验还发现芹菜苷能够抑制ERK1/2的下游产物ACE的mRNA和蛋白表达，进而减少细胞损伤，同时芹菜苷能够激活eNOS的mRNA和蛋白表达，发挥释放NO的作用，从而修复内皮细胞损伤。这种效果在加入ERK1/2特异性抑制剂U0126后更为明显。

目录

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 细胞氧化损伤模型

1．1．1 细胞氧化损伤

1．1．2 细胞模型的建立

1．1．3 细胞模型的应用

1．2 人脐静脉内皮细胞的氧化损伤模型

1．2．1 内皮细胞概述

1．2．2 内皮细胞与高血压的关系

1．2．3 人脐静脉内皮细胞特点

1．2．4 人脐静脉内皮细胞损伤机制

1．3 黄酮类化合物功效

1．4 芹菜黄酮功效

1．5 黄酮类物质对ERK1／2信号通路的调控

1．6 研究目的与意义

1．7 研究内容

第二章 Ang Ⅱ体外诱导HUVECs氧化损伤模型的建立

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 主要仪器和设备

2．1．4 主要试剂制备

2．2 实验方法

2．2．1 HUVECs的培养

2．2．2 实验分组与处理

2．2．3 细胞形态观察

2．2．4 细胞活性测定

2．2．5 总蛋白提取与浓度测定

2．2．6 NO的测定

2．2．7 NOS的测定

2．2．8 MDA的测定

2．2．9 SOD的测定

2．2．10 细胞超微结构的观察

2．2．11 细胞凋亡测定

2．2．12 数据分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 细胞形态的观察

2．3．2 细胞活性

2．3．3 总蛋白含量

2．3．4 NO含量

2．3．5 NOS活力

2．3．6 MDA含量

2．3．7 SOD活力

2．3．8 细胞超微结构

2．3．9 细胞凋亡

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 芹菜苷、3-甲氧基芹菜苷对HUVECs氧化损伤模型的修复

3．1 材料、试剂与仪器

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 实验分组与处理

3．2．2 各指标测定方法

3．2．3 数据分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 细胞形态

3．3．2 细胞活性

3．3．3 总蛋白含量

3，3．4 NO的含量

3．3．5 NOS的活力

3．3．6 MDA的含量

3．3．7 SOD的活力

3．3．8 细胞超微结构

3．3．10 细胞凋亡

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 芹菜苷对HUVECS损伤模型中ERK1／2信号通路的作用

4．1 材料、试剂与仪器

4．1．1 试验材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 试验方法

4．2．1 试剂配制

4．2．2 细胞培养

4．2．3 实验分组与处理

4．2．4 实时定量逆转录聚合酶链式反应

4．2．5 免疫蛋白印迹(Western blotting)

4．2．6 统计学分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 ERK1／2 mRNA的溶解曲线

4．3．2 芹菜苷对细胞中ERK1／2 mRNA和蛋白表达量的影响

4．3．3 ACE mRNA的溶角翠曲线

4．3．4 芹菜苷对细胞中ACE mRNA表达量的影响

4．3．5 芹菜苷对细胞中eNOS mRNA、蛋白表达量的影响

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

致谢

声明