雷公藤内酯醇对前列腺癌细胞雄激素受体的调控机制研究

摘要

第一部分雷公藤内酯醇在转录水平调节前列腺癌细胞内雄激素受体表达的机制研究
　　目的：
　　前列腺癌(prostate cancer, PCa)发病率在我国呈现快速上升态势，雷公藤内酯醇(triptolide，TP)是中药雷公藤的主要提取物之一，已有研究示其对PCa细胞有很强的生长抑制及促凋亡作用。雄激素受体(androgen receptor，AR)是PCa治疗的关键靶点，我们的前期研究表明TP可下调PCa细胞AR的表达。故本研究将从转录水平探索TP下调PCa细胞AR的机制。
　　方法：
　　培养LNCaP细胞并用TP处理，采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测TP处理后LNCaP细胞中AR及其下游靶基因的mRNA和蛋白表达变化;采用RF克隆法构建系列pGL3-AR启动子报告基因载体并转染至LNCaP细胞，检测TP在转录水平调节AR的作用;使用NF-κB抑制剂并采用Westernblot检测分析PI3 K/AKT/NF-κB通路是否参与TP对AR的调控。数据采用GraphPad Prism5软件进行统计学分析。
　　结果：
　　1、TP能呈剂量依赖性下调LNCaP细胞AR的mRNA和蛋白的表达，同时下调AR靶基因PART1(prostate androgen-regulated transcript1)及前列腺特异性抗原(prostatespecific antigen，PSA)的表达。
　　2、成功构建系列pGL3-AR启动子报告基因载体并测序，转染LNCaP细胞后双荧光素酶报告基因检测系统证实其具有启动子活性。
　　3、启动子报告基因实验结果表明，TP能够在转录水平下调AR的表达，且其参与调控的作用位点分布在AR启动子序列-965/+265 bp以内。
　　4、与AR启动子活性相关的PI3K/AKT/NF-κB通路蛋白表达呈TP剂量依赖性下调，TP可能通过NF-κB途径抑制AR转录活性。
　　结论:
　　TP能够在转录水平下调PCa细胞AR的转录活性，此功能可能是通过PI3K/AKT/NF-κB通路实现的。
　　第二部分雷公藤内酯醇在转录后水平调节前列腺癌细胞内雄激素受体表达的机制研究
　　目的：
　　TP对AR表达的调控作用可能是通过对AR蛋白稳定性的调控实现的，而Ca2+参与的钙蛋白酶(calpain)催化的AR降解作用可能是其调节作用的主要机制。因此，此部分研究将从AR蛋白稳定性方面入手，探讨TP对AR蛋白降解的影响及可能参与的相关蛋白酶。
　　方法：
　　TP作用于LNCaP细胞后，Western blot检测钙蛋白酶(calpain)及其抑制蛋白(calpastatin)的表达;使用蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide，CHX)、蛋白酶抑制剂或改变细胞内钙离子浓度的试剂处理细胞后，Western blot检测AR表达的改变。
　　结果：
　　1、使用CHX预先抑制LNCaP细胞的蛋白合成，再使用TP处理细胞，结果证实TP能够在转录后水平下调LNCaP细胞内AR的表达。
　　2、使用特异性calpain抑制剂ALLM处理LNCaP细胞后，可逆转TP所致的AR降解，说明TP调节AR蛋白稳定性的作用可能是通过calpain介导的。
　　3、TP对LNCaP细胞内calpain-1、calpain-2及calpastatin的蛋白表达无影响。
　　4、分别使用Ca2+螯合剂及Ca2+载体下调或上调LNCaP细胞内Ca2+浓度，结果示升高细胞内Ca2+浓度能够下调AR的蛋白表达。表明TP可能通过上调胞内Ca2+浓度进而激活calpain活性来下调AR的表达。
　　结论：
　　TP能够在转录后水平下调LNCaP细胞内AR的表达，其机制可能为:TP能够通过上调胞内Ca2+浓度并激活calpain活性从而起到下调AR蛋白表达的作用。
　　第三部分 calpain-1，calpain-2，calpastatin，calmodulin及AR蛋白在前列腺癌组织中的表达
　　目的：
　　Calpain、calpastatin及钙调蛋白(calmodulin，CaM)均为钙相关蛋白且三者均与AR的蛋白稳定性相关。本部分研究检测前列腺组织中以上钙相关蛋白和AR蛋白的表达，并分析各蛋白表达与PCa临床特征的相关性，旨在探讨钙相关蛋白与PCa发生和发展的关系。
　　方法：
　　收集2013年1月-2015年6月扬州大学临床医学院泌尿外科PCa根治标本及良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)电切标本各25例，采用免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测组织中calpain-1，capian-2，calpastatin，CaM及AR的表达。使用Image-pro-plus6软件检测组织腺体染色区光密度值，并应用SPSS17.0软件进行统计学分析。
　　结果：
　　1、25例BPH及25例PCa组织中均有calpain-1、calpain-2、calpastatin、CaM及AR的表达，且与BPH组织相比，PCa组织中五种蛋白的表达均显著升高（P＜0.001）。
　　2、在BPH及PCa组织中仅calpaspatin与CaM表达间有相关性。
　　3、ROC曲线分析表明calpain-1、calpain-2、calpastatin、CaM及AR均有统计学意义，曲线下面积分别为0.8112、0.9808、0.9824、1.000及0.9680。
　　4、各蛋白表达与患者的年龄、前列腺体积、血清PSA、Gleason评分及神经侵犯之间无任何相关性。
　　结论：
　　Calpain可能在PCa的发生及进展中起促进作用，而calpastatin与CaM在PCa的过表达可能与抑制calpain活性相关，故导致AR在PCa呈高表达状态。Calpain、calpastatin及CaM有成为PCa肿瘤标记物的潜力。

目录

摘要

符号说明

第一部分 雷公藤内酯醇在转录水平调节雄激素受体表达的机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 雷公藤内酯醇在转录后水平调节雄激素受体表达的机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 Calpain-1，calpain-2，calpastatin，calmodulin及AR蛋白在前列腺癌组织中的表达

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述 雷公藤内酯醇抗前列腺癌的机制研究进展

致谢

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