棉大卷叶螟丝素重链基因的克隆、功能验证及在生产上的应用

摘要

棉大卷叶螟(Sylepta derogata Fabricius)是鳞翅目螟蛾科昆虫，分布范围广、寄主种类多，能对多种经济作物产生较大危害。为了进一步研究棉大卷叶螟的吐丝危害机理，本文以棉大卷叶螟的丝素重链基因为研究对象，克隆得到其cDNA全长序列，测定了不同发育阶段棉大卷叶螟吐丝基因的表达量，以及取食不同寄主后棉大卷叶螟吐丝基因的表达量。在此基础上，运用饲喂法干扰棉大卷叶螟丝素重基因的表达，进而影响卷叶螟的吐丝卷叶，并观察干扰表达后对棉大卷叶螟种群发育与蛹重的影响。结果如下:
　　1.根据文献报导的其他昆虫的丝素重链基因，通过RACE法克隆得到棉大卷叶螟丝素重链基因cDNA全长。棉大卷叶螟丝素重链基因cDNA全长为1465bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，开放阅读框全长为1323bp。依据棉大卷叶螟丝素重链基因的核苷酸序列推导其氨基酸序列，估算该蛋白分子量为43.553kDa，等电点pI为6.26。将所获得的基因全长同其他已经登录到GenBank的昆虫丝素重链基因序列进行比对，发现与棉大卷叶螟丝素重链基因序列一致性最高的是外米缀蛾(Corcyra cephalonica)，达到65％，其次为大蜡螟(Galleria mellonella)与琥珀蚕(Antheraea assama)，一致性皆为59％。
　　2.通过实时定量PCR技术，分析了不同发育阶段棉大卷叶螟丝素重链基因的表达量，以及取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素重链基因的表达量。结果表明，丝素重链基因表达量随虫态、虫龄的不同而不同:2龄、4龄幼虫以及预蛹期丝素重链基因表达量相对较高，其中2龄虫丝素重链基因表达量最高;3龄、5龄幼虫丝素重链基因表达量相对较低，蛹期及羽化后丝素重链基因的表达量更低，甚至近于零;取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素重链基因的表达量不同，饲喂苘麻叶片的棉大卷叶螟丝素重链基因的相对表达量最高，棉花次之，木槿最低，且它们之间差异显著。
　　3.通过饲喂法干扰棉大卷叶螟幼虫丝素重链基因的表达，并从菌液浓度、饲喂时间、饲喂的幼虫虫龄等方面研究其对棉大卷叶螟丝素重链基因表达量的影响。菌液浓度试验结果表明，随着饲喂棉大卷叶螟幼虫菌液浓度的增加，丝素重链基因相对表达量下降。喂食不同虫龄棉大卷叶螟幼虫不同天数菌液的试验结果表明，2L、3L、4L幼虫喂食表达dsRNA的菌液后其重链基因表达量均下降，且喂食表达dsRNA的菌液3天、5天后的丝素重链基因表达量比喂食1天的表达量显著下降。同时，2L、4L干扰效果比3L的好。试验结果说明，菌液浓度、饲喂时间、饲喂的幼虫虫龄均会对卷叶螟丝素重链基因的干扰效率产生影响。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 棉大卷叶螟生物学习性与危害

1．1．1 棉大卷叶螟生物学习性

1．1．2 影响棉大卷叶螟种群数量的一些因素

1．1．3 防治对策

1．2 昆虫吐丝概况

1．2．1 丝对昆虫的作用

1．2．2 丝对人类的作用

1．2．3 丝的研究进展

1．3 RNA干扰

1．3．1 RNAi的研究概况

1．3．2 siRNA在昆虫上的应用

1．3．3 应用RNAi对昆虫的研究

1．4 研究目的和意义

第二章 棉大卷叶螟丝素重链基因的克隆

2．1 供试材料

2．1．1 棉大卷叶螟虫源

2．1．2 试验试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 总RNA的提取

2．3 cDNA第一链合成

2．4 棉大卷叶螟丝素重链基因中间片段的扩增

2．4．1 引物设计与合成

2．4．2 丝素重链基因中间片段的扩增

2．4．3 目的基因片段产物的回收与纯化

2．4．4 目的基因产物的连接

2．4．5 连接产物的转化

2．4．6 单菌落PCR检测

2．4．7 测序

2．4．8 序列分析

2．5 丝素重链基因的3’Race

2．5．1 引物设计

2．5．2 3’RACE的扩增

2．6 丝素重链基因的5’Race

2．6．1 引物设计

2．6．2 棉大卷叶螟总RNA中裸露的5’磷酸基团的去除

2．6．3 mRNA 5’帽子结构的去除

2．6．4 5’RACE Adaptor的连接

2．6．5 反转录

2．6．6 PCR扩增

2．7 序列分析

2．8 结果与分析

2．8．1 丝素重链基因中间片段扩增结果

2．8．2 3’RACE扩增结果

2．8．3 5’RACE扩增结果

2．8．4 开放阅读框扩增结果

2．8．5 序列分析

2．9 小结与讨论

第三章 棉大卷叶螟丝素重链链基因在不同发育阶段以及饲喂不同寄主后的表达分析

3．1 供试材料

3．1．1 棉大卷叶螟虫源

3．1．2 试验试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 不同发育阶段处理

3．2．2 不同寄主处理

3．2．3 不同处理样品的RNA提取

3．2．4 反转录

3．2．5 引物设计与合成

3．2．6 重链基因实时定量分析

3．2．7 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 引物与内参基因的可靠性

3．3．2 棉大卷叶螟不同发育阶段丝素重链基因的相对表达量

3．3．3 棉大卷叶螟饲喂不同寄主后丝素重链基因的相对表达量

3．4 小结与讨论

第四章 棉大卷叶螟丝素重链基因的RNA干扰

4．1 供试材料

4．1．1 棉大卷叶螟虫源

4．1．2 试验试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 dsRNA表达载体的构建

4．2．1 引物的设计与合成

4．2．2 目标基因片段的制备

4．2．3 连接与转化

4．2．4 提取质粒

4．2．5 酶切

4．2．6 连接

4．2．7 转化至HT115大肠杆菌

4．2．8 dsRNA在大肠杆菌中的表达

4．2．9 dsRNA检验

4．2．10 喂食表达dsRNA细菌液的试验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 dsRNA在大肠杆菌中的表达

4．3．2 饲喂菌液对棉大卷叶螟幼虫的影响

4．3．3 棉大卷叶螟幼虫喂食不同浓度菌液后丝素重链基因相对表达量变化

4．3．4 不同虫龄棉大卷叶螟幼虫喂食菌液不同天数后丝素重链基因的相对表达量

4．3．5 喂食棉大卷叶螟幼虫菌液对卷叶螟生长发育的影响

4．4 小结与讨论

第五章 全文总结与展望

参考文献

致谢

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