棉大卷叶螟丝素P25基因的克隆、表达分析及功能验证

摘要

棉大卷叶螟(Sylepta derogata Fabricius)属鳞翅目螟蛾科，是一种分布广泛的多食性害虫。为了深入了解棉大卷叶螟的吐丝机理，本文研究了棉大卷叶螟丝素P25基因，通过基因克隆技术得到其cDNA序列全长，并检测分析在不同发育阶段、取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素P25基因的相对表达量。以此为基础，进行RNA干扰试验，采用饲喂法干扰其丝素P25基因的表达，从而进行功能验证。主要研究结果如下:
　　1、通过比对其他已知的鳞翅目昆虫的丝素P25基因，运用RACE法克隆得到棉大卷叶螟丝素P25基因全长。棉大卷叶螟丝素P25基因cDNA全长为859bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，编码区全长为663bp，并将所获得的基因全长提交到GenBank，登录号为KY792994。依据棉大卷叶螟丝素P25基因的核苷酸序列转换为其氨基酸序列，并加以分析，估算该蛋白分子量为25.653kDa，等电点pI为8.02。将所获得的基因全长同已经登录到GenBank的其他昆虫丝素P25基因序列进行同源性比对，与大蜡螟（Galleria mellonella）的同源性最高，达到63％，其次为外米缀蛾（Corcyra cephalonica），同源性为62％。
　　2、运用实时定量PCR技术，检测分析在不同发育阶段、取食不同寄主后棉大卷叶螟丝素P25基因的相对表达量。分析结果表明，丝素P25基因的相对表达量与棉大卷叶螟的虫龄、虫态变化紧密相关。P25基因相对表达量的特点主要体现在2L幼虫和预蛹期各有一个高峰，其中预蛹期的表达量最高;1龄，3龄，5龄幼虫丝素P25基因的表达量相对较低;蛹期及羽化后，丝素P25基因的表达量快速下降，近乎于零;饲喂苘麻叶片的棉大卷叶螟2龄幼虫丝素P25基因的相对表达量最高，蜀葵和棉花次之，且蜀葵略高于棉花，木槿最低。
　　3、将表达棉大卷叶螟丝素P25基因dsRNA的菌液以饲喂法的方式干扰其幼虫目标基因的表达。喂食不同菌液浓度的试验结果表明，喂食表达dsRNA菌液后相对表达量均有所下降。而喂食不同虫龄棉大卷叶螟幼虫不同天数菌液的试验结果表明，饲喂菌液天数越长，表达量均会呈现下降趋势，其中3龄幼虫的下降幅度要小于其他虫龄，且对5龄幼虫的干扰效果最好。在不同寄主上饲喂菌液的试验结果表明，饲喂菌液后，不同寄主上的棉大卷叶螟2龄幼虫丝素P25基因表达量均有所下降，其中以苘麻为寄主的幼虫丝素P25基因表达量显著下降。以上试验结果表明菌液浓度、取食时间、取食虫龄、取食寄主均会对丝素P25基因干扰效率产生影响。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 昆虫吐丝概况

1．1 昆虫吐丝行为的生物学意义

1．2 棉大卷叶螟的生物学习性与为害特征

2 丝的形态学研究进展

2．1 泌丝腺体的组成部分

2．2 丝的结构与组成

3 RNA干扰研究概况

3．1 RNA干扰的作用机制

3．2 RNA干扰技术防治害虫的应用

4 研究目的和意义

第二章 棉大卷叶螟丝素P25基因的克隆

2．1 试验材料

2．1．1 试验虫源

2．1．2 试验试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 总RNA的提取

2．3 cDNA第一链合成

2．4 棉大卷叶螟丝素P25基因中间片段的扩增

2．4．1 引物设计与合成

2．4．2 丝素P25基因中间片段的扩增

2．4．3 目的基因片段产物的回收与纯化

2．4．4 目的基因产物的连接

2．4．5 连接产物的转化

2．4．6 单菌落PCR检测

2．4．7 测序

2．4．8 序列分析

2．5 丝素P25基因的3’Race

2．5．1 引物设计

2．5．2 3’RACE的扩增

2．6丝素P25基因的5’Race

2．6．1 引物设计

2．6．2 棉大卷叶螟总RNA中裸露的5’磷酸基团的去除

2．6．3 mRNA 5’帽子结构的去除

2．6．4 5’RACE Adaptor的连接

2．6．5 反转录

2．6．6 PCR扩增

2．7 序列分析

2．8 结果与分析

2．8．1 丝素P25基因中间片段扩增结果

2．8．2 3’RACE扩增结果

2．8．3 5’RACE扩增结果

2．8．4 开放阅读框扩增结果

2．8．5 序列分析

2．9 讨论

第三章 丝素P25基因在棉大卷叶螟不同发育阶段以及饲喂不同寄主后的表达分析

3．1 试验材料

3．1．1 棉大卷叶螟虫源

3．1．2 试验试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 不同发育阶段处理

3．2．2 不同寄主处理

3．2．3 不同处理样品的RNA提取

3．2．4 反转录

3．2．5 引物设计与合成

3．2．6 丝素P25基因实时定量分析

3．2．7 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 引物与内参基因的可靠性

3．3．2 棉大卷叶螟不同发育阶段丝素P25基因的相对表达量

3．3．3 棉大卷叶螟饲喂不同寄主后丝素P25基因的相对表达量

3．4 小结与讨论

第四章 棉大卷叶螟丝素P25基因的RNA干扰

4．1 供试材料

4．1．1 试验虫源

4．1．2 试验试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 试验步骤

4．2．1 引物的设计与合成

4．2．2 目标基因片段的制备

4．2．3 连接与转化

4．2．4 提取质粒

4．2．5 酶切

4．2．6 连接

4．2．7 转化至HT115大肠杆菌

4．2．8 dsRNA在大肠杆菌中的表达

4．2．9 dsRNA检验

4．2．1 0 喂食表达dsRNA菌液的试验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 dsRNA在大肠杆菌中的表达

4．3．2 饲喂菌液对棉大卷叶螟幼虫的影响

4．3．3 饲喂不同浓度菌液对棉大卷叶螟幼虫丝素P25基因表达量的影响

4．3．4 不同虫龄棉大卷叶螟幼虫喂食菌液不同天数后丝素P25基因的相对表达旦

4．3．5 饲喂菌液对不同寄主上棉大卷叶螟幼虫丝素P25基因表达量的影响

4．4 小结与讨论

参考文献

致谢

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