苜蓿黄酮对奶牛生产性能、瘤胃代谢和免疫性能影响的研究

摘要

紫花苜蓿是我国最重要的栽培牧草，广泛分布于西北、华北等地区，因具有品质好、产量高以及适应性强的优点而被称为“牧草之王”。黄酮类化合物是苜蓿中一种主要的生物活性物质。虽然黄酮的研究报道较多，但对苜蓿黄酮在动物上的研究还较少，其作用机理在许多方面还不清楚。目前，苜蓿黄酮对奶牛的生产性能及其机理的研究鲜见报道。因此，本试验研究苜蓿黄酮对奶牛生产性能、瘤胃代谢和免疫性能的影响及其机理，为开发利用苜蓿黄酮提供科学依据。
　　试验一、苜蓿黄酮对奶牛生产性能和血液生化指标的影响
　　本试验为了研究苜蓿黄酮对奶牛生产性能和血液生化指标的影响。试验选取4头装有瘤胃瘘管的初产奶牛（平均体重为500±25 kg，泌乳天数为79±6 d），采用4×4拉丁方设计进行试验。饲喂奶牛全混合型日粮，每组分别添加0g(A组)、20 g（B组）、60 g（C组）和100 g（D组）的苜蓿黄酮。试验期为4期，每期为24 d，其中10d预饲期。结果为:1）与试验A组相比，试验C组的干物质采食量和乳糖率显著提高(P＜0.05)，而乳脂率则降低。乳蛋白率、总固形物和体细胞数量均随着苜蓿黄酮添加剂量的升高呈降低趋势(0.05＜P≤0.10)。苜蓿黄酮提高了产奶量、4％标准乳和乳料比，但各组间无显著差异。2）随着苜蓿黄酮添加水平的升高，粗蛋白和中性洗涤纤维的消化率呈线性升高趋势(0.05＜P≤0.10)。3)随着苜蓿黄酮添加剂量的升高，血清中总蛋白(TP)和碱性磷酸酶(ALP)含量呈降低趋势(P=0.08);试验C组血清中总胆固醇(TC)高密度脂蛋白(HDL)含量最高。4）与试验A组相比，试验D组血清T3和T4浓度显著升高（P＜0.05）。血清中的催乳素(PRL)浓度随苜蓿黄酮添加剂量的升高呈升高趋势。结果表明，苜蓿黄酮能够提高奶牛的采食量和营养物质的消化率，调节激素的分泌以及乳糖、乳脂和乳蛋白的合成。
　　试验二、苜蓿黄酮对奶牛瘤胃发酵和细菌菌群结构与组成的影响
　　本试验研究苜蓿黄酮对奶牛瘤胃发酵和细菌菌群结构与组成的影响，试验设计同试验一。结果如下:1）苜蓿黄酮降低乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的含量，但各组之间无显著性差异。2）试验C组细菌门和属总数以及ACE、Chao和Shannon指数均显著高于试验A和B组(P＜0.05)。3）在门和纲水平，随着苜蓿黄酮添加量的升高，软壁菌门和柔膜菌纲丰度、广古菌门(P=0.04)及甲烷微菌纲(P=0.06)丰度呈线性升高趋势，而梭杆菌门的梭杆菌纲(P=0.04)丰度和蓝细菌门的4C0d-2纲(P=0.07)则降低;试验C组装甲菌门的丰度显著高于试验A和B组(P＜0.05)。4)在属水平，试验C组的Mogibacterium和锥形杆菌属的丰度显著低于试验A组(P＜0.05)，而假单胞菌属的丰度显著高于试验B组(P＜0.05)。试验D组罗氏菌属的丰度显著高于试验C组(P＜0.05)，而萨特菌属则显著低于试验B组(P＜0.05);随着苜蓿黄酮添加量的升高，无甾醇支原属、琥珀酸菌属、产吲哚萨顿菌属和螺旋体属的丰度呈线性下降趋势(0.05＜P＜0.10)。结果说明，苜蓿黄酮能够提高瘤胃细菌的丰富度和多样性，但对瘤胃发酵无显著影响。
　　试验三、苜蓿黄酮对奶牛抗氧化和免疫性能的影响
　　研究苜蓿黄酮对奶牛免疫性能的影响，试验设计同试验一。结果为:1）随着苜蓿黄酮的添加剂量的升高，奶牛血液中性粒细胞数量和中性粒细胞比例、血小板数量和血小板压积升高，而淋巴细胞数量则降低。2）试验B组奶牛血清中Ig G含量、CD4+T淋巴细胞比例、CD4+/CD8+比值以及GM-CSF、IL-4和IFN-γ相对表达量显著高于其他各组(P＜0.05)，而CD8+T淋巴细胞比例的结果则相反。3)与试验A组相比，试验D组的GSH-Px活性升高(P＜0.05)，试验B组的CAT活性显著升高，而试验C组的MDA含量显著降低(P＜0.05)。结果表明，苜蓿黄酮能够通过调节血液免疫细胞数量和细胞因子的活性以及提高抗氧化能力来调节机体的免疫性能。
　　试验四、苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳成分合成的影响
　　本试验研究苜蓿黄酮对体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳成分合成的影响。将乳腺上皮细胞分成5组，每组培养基中分别含有0（对照组）、25、50、75和100μg/mL苜蓿黄酮，细胞在条件为37℃，5％CO2下进行培养。结果为:1)培养96 h时，75μg/mL组的细胞增殖能力显著高于其他各组(P＜0.01或P＜0.05)。2)与对照组相比，50μg/mL组细胞的GSH-Px、CAT活性和NO含量显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，而LDH活性显著降低(P＜0.01);75μg/mL组细胞的MDA显著降低(P＜0.01)。3）与对照组相比，25μg/mL组显著降低LAT1、AK2、S6K1、mTOR、4EBP1、eIF4E、FATP1、FATP4、β-1,4-Gal T和HK2的表达(P＜0.01)，但能显著提高ACACA和Glut8的表达(P＜0.01或P＜0.05);50μg/mL组显著提高了PPAR-γ、 FATP4、SCD1、FABP3和FAS的表达(P＜0.01)。结果表明，苜蓿黄酮能够提高细胞的抗氧化能力，促进细胞增殖;能够调节乳脂、乳蛋白和乳糖合成相关基因的表达来调节乳成分合成。
　　试验五、苜蓿黄酮对高温下奶牛乳腺上皮细胞的影响
　　本试验研究苜蓿黄酮对高温下体外培养奶牛乳腺上皮细胞的影响。将乳腺上皮细胞分成5组，每组培养基中分别含有0（对照组）、25、50、75和100μg/mL苜蓿黄酮，同时置于细胞培养箱37℃，5％ CO2培养48 h，再在42℃恒温水浴锅中水浴处理1h后返回细胞培养箱培养12h，检测细胞活性、抗氧化指标和相关基因的表达。结果显示:1）添加25μg/mL组的细胞活性显著高于对照组和50μg/mL组(P＜0.05)，其他各组之间差异不显著。2）相对于对照组，50～100μg/mL组细胞的GSH-Px活性升高(P＜0.01)，LDH和MDA含量降低(P＜0.01或P＜0.05)，而CAT活性无显著性差异。3）相对于对照组，75μg/mL组细胞Caspase3、P53和Socs3基因表达降低(P＜0.01)，Stat3和Socs1基因表达升高(P＜0.05);25μg/mL组Stat1基因表达升高(P＜0.05)。苜蓿黄酮对细胞Bcl-2和Fas基因表达无显著影响。综上所述，在高温下，苜蓿黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞抗氧化能力和抑制细胞凋亡，进而提高细胞的活性。
　　试验六、苜蓿黄酮对脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮细胞凋亡和乳成分合成的影响
　　本试验研究苜蓿黄酮对脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮细胞凋亡和乳成分合成的影响。将乳腺上皮细胞分成3组，每组培养基中分别0μg/mL的LPS和苜蓿黄酮(对照组，Con)、1μg/mL的LPS(L)、1μg/mL的LPS和75μg/mL的苜蓿黄酮(L+F)，细胞在条件为37℃，5％ CO2下进行培养。结果为:1）在LPS刺激下，培养12h和24 h的细胞活性显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而添加苜蓿黄酮能够提高培养12h的细胞活性(P＜0.05)。2)在LPS刺激下，细胞内的ROS浓度显著升高(P＜0.01)，而添加苜蓿黄酮能够显著降低ROS浓度(P＜0.01)。3）在LPS刺激下，细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4和MyD88基因的表达均显著升高(P＜0.01)，而添加苜蓿黄酮能够显著降低IL-1β和TLR2基因的表达(P＜0.01)。4）在LPS刺激下，细胞P53、P38和Caspase3蛋白的表达量显著升高(P＜0.01)，而添加苜蓿黄酮能够显著降低P53和P38的表达量(P＜0.05)。5）在LPS刺激下，细胞的PPAR-γ、 SCD1、FAB3、κ-CS、JAK2和mTOR的表达量显著降低(P＜0.01)，SREBP1、CAT1和eIF4E表达量显著升高(P＜0.01或P＜0.05);而添加苜蓿黄酮能够显著提高PPAR-γ、 S6K1、Glut1、Glut4和Glut8的表达量(P＜0.01或P＜0.05)和降低FA TP1和eIF4E表达量(P＜0.05)。结果表明，LPS能够促使细胞产生炎症，降低细胞活性，而苜蓿黄酮能够抑制细胞凋亡，提高细胞活性，进而发挥抗炎作用。LPS能够抑制乳蛋白和乳脂的合成，而添加苜蓿黄酮能够促进乳蛋白的合成，但对乳脂合成影响不大。LPS刺激下，添加苜蓿黄酮能够促进乳糖的合成。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 黄酮类化合物的研究进展

1．1 黄酮类化合物的吸收和代谢

1．2 黄酮类化合物的作用

1．3 黄酮类化合物在动物上的应用研究

2 黄酮类物质对瘤胃代谢的影响

2．1 黄酮类化合物对瘤胃原虫的影响

2．2 黄酮类化合物对瘤胃细菌的影响

2．3 黄酮类化合物对瘤胃真菌的影响

3 乳脂、乳蛋白和乳糖的合成与调控

3．1 乳脂的合成与调控

3．2 乳蛋白的合成与调控

3．3 乳糖的合成与调控

4 研究目的和内容

4．1 研究目的与意义

4．2 研究内容

4．3 技术路线

第二章 试验部分

试验一 苜蓿黄酮对奶牛生产性能、血液生化和瘤胃发酵的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验二 苜蓿黄酮对奶牛瘤胃发酵和细菌菌群结构和组成的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验三 苜蓿黄酮对奶牛抗氧化和免疫性能的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验四 苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳成分合成的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验五 苜蓿黄酮对高温下奶牛乳腺上皮细胞的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验六 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮细胞凋亡和乳成分合成的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

1 全文结论

2 创新点

3 进一步研究的问题

参考文献

致谢

个人简历

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