新城疫病毒La Sota C5株反向遗传操作平台的优化及Class Ⅰ/Ⅱ嵌合弱毒株的构建与免疫原性评价

摘要

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)强毒株引起的一种具有高度传染性的烈性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为需报告疾病之一。NDV属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)，禽腮腺炎病毒属(Avuluvirus)的成员，是单股、负链、不分节段、有囊膜的RNA病毒。本研究对实验室前期构建的La Sota C5反向遗传平台进行了改造和优化，发现改造后的感染性克隆GLa SotaC5与La Sota序列完全一致;且其拯救效率有明显提高。在此基础上构建了JS10M/F/HN三个基因替换的重组病毒GLa Sota C5M/F/HN，并比较了其免疫原性。
　　1.新城疫病毒La Sota C5株感染性克隆的改造与优化
　　参照La Sota C5株的全基因序列，将基因组分成4段，经RT-PCR从La Sota C5株感染的尿囊液中扩增目的片段，分别连入克隆载体中;然后顺次克隆到pMD-20T载体中，构建含有La Sota C5基因组大部分片段的中间质粒T-ABCD。该质粒和前期构建的TVT-LT分别经BglⅡ酶切后回收大片段，最后连接为含有病毒全长cDNA的转录载体TVT-G LaSota C5。将三个辅助质粒与全长转录载体共转染能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞。转染后72h收集细胞，反复冻融三次后接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔。收集24h后死亡鸡胚尿囊液，按OIE标准测其血凝(HA)效价，并用RT-PCR方法和基因测序鉴定是否为拯救病毒。结果显示第一代尿囊液HA效价为28，传代三次后，HA滴度上升为211。序列测定表明拯救病毒带有引入的遗传标记，证明成功拯救出了具有感染性的GLa Sota C5株新城疫病毒。La Sota C5株反向遗传操作平台的建立为后续研究新城疫弱毒各结构基因功能、开发新型新城疫病毒疫苗等的研究奠定了基础。
　　2.嵌合新城疫ClassⅠ/ClassⅡ弱毒疫苗候选株的构建
　　RT-PCR方法分别扩增出JS10株的M，F和HN基因，T-A克隆测序后经PCR定点诱变连续缺失两个酶切位点，再通过定向克隆构建成中间质粒至T-AB2中;使用两端的PacⅠ和ASCⅠ单酶切位点将JS10株的M，F和HN基因整体与TVT-GLa Sota C5的相应片段替换，从而构建成三基因替换的重组转录载体TVT-GLa Sota C5M/F/HN。随后将TVT-GLa Sota C5M/F/HN与3个辅助质粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P共转染BSR-T7/5细胞，成功拯救出致弱的病毒GLa Sota C5M/F/HN，其血凝价210、鸡胚半数感染量(EID50)为10102EID50/ml、鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)大于120h、脑内接种致病指数(ICPI)为022、静脉接种致病指数(IVPI)为0。经SPF鸡胚连续传12代后未发现生物学特性改变。上述结果表明拯救的病毒毒力己明显致弱、血凝价明显升高、遗传稳定性良好，是一个较为理想的疫苗候选株。
　　3.嵌合新城疫ClassⅠ/ClassⅡ弱毒疫苗候选株的免疫原性评价
　　为了比较GLa Sota C5M/F/HN与常用疫苗株La Sota的免疫原性差异，首先制备了GLa Sota C5M/F/HN和La Sota的高免血清并对不同基因型的NDV毒株对进行交叉血凝抑制试验。比较后发现，GLa Sota C5M/F/HN的抗血清对受试的强毒株的HI效价均高于La Sota的抗血清。随后选取了5株强毒与两种血清分别进行细胞交叉中和试验、鸡胚交叉中和试验，结果显示GLa Sota C5M/F/HN的抗血清对所有强毒株的中和效价均比LaSota抗血清高3-5倍，对ClassⅠ强毒9a5b的中和效价是La Sota的10倍。最后将GLa Sota C5M/F/HN和La Sota分别免疫SPF鸡，然后用ClassⅡ基因Ⅶ型强毒株ZJ1攻毒，Ⅸ强毒F48和ClassⅠ强毒9a5b攻毒比较两者的免疫效果。结果显示上述两者均能提供100％的保护，但GLa Sota C5M/F/HN能显著降低免疫鸡群攻毒后的排毒率。上述试验表明，GLa Sota C5M/F/HN有望成为新的弱毒疫苗候选株。
　　4.嵌合新城疫ClassⅠ/ClassⅡ弱毒疫苗候选株的黏膜免疫水平评价
　　选取60只SPF雏鸡，随机分为A、B、C3组，每组20只。A组和B组分别于7日龄时以滴鼻点眼方式免疫GLa Sota C5M/F/HN和La Sota，免疫剂量均为106EID50，C组为不接种病毒对照组。在免疫后第1d、4d、7d、14d，每组抽取5只鸡，处死后采集各种黏膜洗脱液，间接ELISA检测其IgM，IgG和SIgA抗体水平。研究结果表明:两株病毒免疫7日龄雏鸡后均可引起机体的局部黏膜免疫应答，且GLa Sota C5M/F/HN所诱导的黏膜免疫水平略高于La Sota。对免疫球蛋白亚类检测表明，系统性免疫应答主要以IgG抗体为主，而局部黏膜免疫应答则以SIgA抗体为主。

目录

摘要

Abstract

英文缩略表

第一章 文献综述

1．新城疫病毒概述

2．NDV毒力的评价指标

3．病毒的入侵机制与毒力

4．病毒的复制与毒力

5．病毒免疫逃避机制与毒力

6．病毒非编码区基序与毒力

7．新城疫病毒反向遗传操作技术概述

7．1 NDV全基因组cDNA的克隆构建

7．2 辅助质粒功能验证的必要性

7．3 反向遗传技术在NDV毒力机制解析方面的应用

7．4 反向遗传技术在NDV作为疫苗载体方面的应用

第二章 新城疫病毒La Sota c5株反向遗传平台的改造与优化

1 材料

1．1 毒株、细胞株和鸡胚

1．2 质粒和菌株

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 分子生物学软件

2 方法

2．1 毒株的扩增

2．2 病毒RNA的提取及反转录

2．4 T-A克隆及鉴定

2．5 全长基因组cDNA转录载体的构建

2．6 全长感染性克隆的鉴定

2．7 TVT-G La Sota C5的拯救

2．8 拯救病毒的HA测定

3．2 重构建转录载体TVT-GLa Sota C5的酶切鉴定

3．4 TVT-GLa Sota C5株的生物学特性分析

4 讨论

第三章 嵌合新城疫Class Ⅰ／Class Ⅱ弱毒疫苗候选株的构建

1 材料

1．1 病毒、细胞和鸡胚

1．2 菌株、质粒和载体

1．3 常用试剂

1．4 主要仪器

1．5 主要化学试剂和细菌培养基

1．6 1％鸡红细胞悬液

1．7 分子生物学软件

2 方法

2．2 TVT-GLa Sota C5中引入Ⅰ酶切位点PacⅠ和ASCⅠ

2．3 重组转录载体TVT-GLa Sota C5M／F／HN的构建模式

2．4 重组质粒TVT-GLa Sota C5M／F／HN的的酶切鉴定

2．5 三基因替换的重组转录载体的转染及鉴定

2．6 重组病毒的部分生物学特性测定

3 结果

3．2 TVT-GLa Sota C5M／F／HN的拯救与鉴定

3．3 拯救病毒与母本病毒的部分生物学特性比较

4 讨论

第四章 嵌合ClassⅠ／ClassⅡ弱毒疫苗候选株的免疫原性比较

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 病毒扩增及特性鉴定

2．2 交叉血凝抑制结果

2．3 交叉中和结果

2．4 交叉保护结果

3 讨论

第五章 两种新城疫弱毒疫苗诱导黏膜免疫应答的比较

1 材料

2 方法

2．1 病毒扩增保存

2．2 病毒EID50测定

2．3 两株弱毒感染鸡的组织病理检查

2．4 黏膜免疫试验设计

2．5 黏膜免疫样品采集方法

2．6 间接ELISA方法的建立

2．7 数据统计与分析

3 结果

3．1 两株弱毒的体内增殖比较

3．2 最佳抗原包被浓度和酶标抗体工作浓度确定

3．3 确定间接ELISA方法最佳反应条件

3．4 唾液中抗体水平

3．5 气管冲洗液中抗体水平

3．6 肺冲洗液中抗体水平

3．7 肠冲洗液中抗体水平

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

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