ZmPIFs基因的克隆、表达及AtPIFs基因的抗旱功能研究

摘要

PIFs因子（phytochrome interacting factors）或称PILs因子(phytochrome interactingfactor-like)，属于bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子家族的第15亚族，在植物信号调控网络中发挥着重要的作用。近年来对环境信号和激素信号分子水平上的交叉作用及协同调控研究中，PIFs亚家族被认为起到“枢纽”的作用。目前针对PIFs的研究主要依赖于模式植物拟南芥，而在其他作物（水稻、小麦、玉米等）中的研究还非常少。
　　根据拟南芥PIFs转录因子的序列，通过序列比对从PlantTFDB数据库的308个玉米bHLH转录因子中鉴定出了6个PIFs类转录因子，分别命名为ZmP IF1、ZmPIF2、ZmPIF3、ZmPIF4、ZmPIF5和ZmPIF6。利用生物信息学方法对ZmPIFs家族的基因结构、蛋白质保守结构域和系统发生进行了分析，序列比对发现6个ZmPIFs转录因子都具有bHLH结构域和APB结构区域，其中ZmPIF1、ZmPIF2、ZmPIF3还具有APA结构区域。进化树分析发现，ZmPIF1、ZmPIF2、ZmPIF3和AtPIF3、AtPIF1， OsPIL15、OsPIL16同源关系较近，并且都具有APA结构域。酵母双杂交实验结果表明ZmPIF1、ZmPIF2、ZmPIF3、ZmPIF4、ZmPIF5和ZmPIF6均与ZmPhyB1互作，其中ZmPIF1、ZmPIF2和ZmPIF3还能与ZmPhyA1互作，说明ZmPIFs能作为光敏色素互作因子发挥作用。
　　利用实时荧光定量PCR技术，研究了这6个ZmPIFs家族基因在玉米不同发育期的表达特性，结果显示基因在玉米的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、籽粒中均有表达，且具有一定的组织表达特异性。分析玉米6个ZmPIFs基因在一天中不同时间点的表达情况发现均具有节律性。干旱、高盐、高温、低温等非生物胁迫处理后，ZmPIFs基因对非生物胁迫有不同的反应，推测它们可能参与玉米应答非生物胁迫的过程。为了进一步探究它们可能参与的激素信号路径，用ABA、GA、JA、BR、IAA、ETH等6种植物激素处理玉米，结果发现6种ZmPIFs基因的表达对6种植物激素响应各不相同，说明ZmPIFs与GAs、ABA、BRs、JA、生长素及乙烯多种激素信号相关联，推测PIFs是整合植物生长发育外部信号与内部信号的关键节点。
　　6个ZmPIFs的表达均受PEG模拟的干旱胁迫诱导，为了进一步验证PIFs转录因子的耐旱性及耐盐性功能，本研究分别构建了ZmPIF1、ZmPIF3、AtPIF1、AtPIF3的表达载体，通过蘸花侵染的方式转化拟南芥，经过抗性筛选，获得T3代纯系。PCR及qRT-PCR结果表明基因已经整合入拟南芥的基因组中，并在转录水平得到表达。
　　通过拟南芥pif1及pif3突变体的杂交获得PIF1及PIF3双突变。对野生型、PIF1、PIF3的过表达和突变体以及if1pif3双突变体进行蒸腾表型的观察发现，突变体的蒸腾速率明显低于野生型，而PIF1与PIF3过表达材料的蒸腾速率明显高于野生型;同样的结果也出现在ZmPIF1、ZmPIF3转基因拟南芥中。为进一步验证蒸腾速率的差别，测定了它们的离体叶片失水率，结果显示，转基因株系离体叶片失水率明显低于野生型，而突变体的离体叶片失水率明显高于野生型。因此PIFs能通过减少蒸腾来来达到节水耐旱的目的。
　　以上研究结果揭示了PIFs基因在非生物胁迫应答中的作用，为进一步建立PIFs基因参与的耐旱调控网络模型奠定基础。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 PIFs转录因子亚家族的结构与分类

2 植物PIFs的基本生物学功能

2．1 参与种子萌发

2．2 参与胚轴生长

2．3 参与调节叶绿素合成

2．4 参与调控细胞分化

2．5 参与调节生物钟

3 植物PIFs参与植物激素信号的转导

3．1 赤霉素(GA)信号响应

3．2 脱落酸(ABA)信号响应

3．3 油菜素内酯(BR)信号响应

3．4 茉莉酸类(JA)信号响应

3．5 生长素信号响应

3．6 乙烯信号响应

4 PIFs的研究小结及本研究的目的和意义

第二章 ZmPIFs基因的克隆及表达分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 ZmPIFs基因生物信息学分析

3．2 ZmPIFs基因的克隆

3．3 ZmPIFs与光敏色素的互作验证

3．4 ZmPIFs亚家族基因的表达分析

4 讨论

4．1 玉米PIFs转录因子的鉴定与组织特异性

4．2 玉米PIFs转录因子表达的节律特征

4．3 玉米PIFs转录因子与植物抗逆

4．4 玉米PIFs转录因子参与激素信号路径

4．5 玉米PIFs转录因子总结

第三章 AtPIFs基因的抗旱功能研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 植物材料

2．2 细菌菌株和质粒

2．3 化学试剂和酶制剂

2．4 实验方法

3 结果与分析

3．2 获得转基因T3代纯系

3．3 转基因拟南芥中目的基因的表达

3．4 获得F2代双突变体

3．5 转录因子与蒸腾的关系分析

4 讨论

参考文献

附录

论文发表、科研创新及国家专利申请

致谢

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