玉米NDH复合体核基因进化分析和NdhL亚基超表达水稻的耐盐性光合机制研究

摘要

随着盐碱地面积逐渐增大，盐胁迫已成为制约作物产量的一个重要的非生物胁迫因素。因此，不断探究作物耐盐的生理机制以提高粮食的产量和品质是人类不断追求的目标。高等植物NDH复合体介导的围绕PSⅠ的循环电子传递(CET-PSⅠ)是植物适应各种自然环境胁迫所产生的一个十分重要的保护机制。由于C4植物CO2浓缩机制需要额外ATP，其CET能力强于C3植物。NDH的表达变化是造成C4植物和C3植物CET强弱差异的主要因素。在三大粮食作物中，玉米和水稻分别属于C4和C3植物。本研究基于生物信息学方法全基因组鉴定玉米NDH复合体核编码基因，对鉴定出的基因基于基因家族分别开展系统进化分析，筛选C3和C4植物中可能发生功能分化的基因，并对玉米中筛选到的经历正选择作用的基因家族中的ZmNdhL1基因，在水稻中进行转基因超表达研究，比较分析转基因株系与野生型植株在盐胁迫下光合生理特性差异，主要结果如下:
　　1、以17个NDH复合体核编码的亚基蛋白结构域为查询序列，搜索玉米、拟南芥、水稻和高粱参考基因组，共鉴定出27个玉米基因，22个拟南芥基因，23个水稻基因和23个高粱基因。依据基因重复与树图将上述NDH核基因的进化树分为三类。A类:四个物种构建出的树图为单簇且在四个物种中的基因均为单拷贝基因，此类进化树有8个;B类:四个物种构建的树图都为单簇，但在C4作物玉米或高粱中的基因有两个拷贝，此类进化树有5个;C类:四个物种构建的树图有两个以上的同源基因簇，此类进化树有4个。经正选择作用检测发现，NdhL和PnsB2两个基因家族经历了正选择作用。
　　2、对玉米中NdhL和PnsB2两个基因家族的基因实时荧光定量分析发现，ZmNdhL1表达量最高，该基因在叶中高表达，受盐、干旱、低温非生物胁迫诱导表达。从具有强CET活性的玉米自交系ZM395中克隆了该基因的全长cDNA，其开放阅读框(ORF)为588bp，编码195个氨基酸。构建了该基因过表达载体，利用农杆菌介导法转化水稻，经过潮霉素抗性鉴定、PCR和RT-PCR鉴定筛选出24个转基因植株，其中转基因植株OE3和OE13表达最高，被用于后续研究。
　　3、测定转基因和野生型植株叶片卷曲程度和叶绿素荧光动力学曲线发现，在对照情况下，超表达株系与野生型之间差异不明显。在200mM盐处理条件下，与野生型相比，超表达株系叶片卷曲程度低;作用光关闭后叶绿素荧光瞬间上升幅度大;PSⅠ的最大光化学效率Y(Ⅰ)、PSⅡ的最大光化学效率Y(Ⅱ)、PSⅠ电子传递速率ETRI、PSⅡ电子传递速率ETRⅡ下降幅度小;快速叶绿素荧光OJIP曲线J点下移， K-band峰值小;延迟荧光诱导曲线的I1点和I2点下降幅度小。上述结果表明，超表达株系的耐盐性优于野生型。ZmNdhL1基因的过表达提高了植株的CET活性，使得光合电子传递链的放氧复合体(OEC)和电子由原初醌受体QA向下游传递的活性受伤害程度变轻，从而降低了盐胁迫对PSⅠ和PSⅡ的伤害。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 围绕PSI的循环电子传递

1．2 NDH复合体的研究进展

1．2．1 NDH复合体的发现

1．2．2 NDH复合体的结构及编码基因

1．2．3 NDH复合体的作用机理

1．2．4 NDH复合体的生理功能

1．2．5 NDH复合体介导的CET在C4植物中的重要性

1．3 植物基因家族分子进化机制

1．3．1 基因重复

1．3．2 适应性进化

1．4 研究的目的和意义

第二章 NDH复合体的适应性进化

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 序列数据来源

2．2．2 多序列比对和构建系统进化树

2．2．3 正选择作用检测

2．3 结果与分析

2．3．1 玉米NDH复合体基因的鉴定和分析

2．3．2 玉米NDH复合体核编码基因的染色体分布

2．3．3 NDH复合体基因家族的系统发育分析

2．3．4 玉米NDH复合体基因经历的选择压力

2．4 讨论与小结

第三章 ZmNdhL1基因的克隆及ZmNdhL1超表达水稻株系的狱获得

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 本实验用到的引物

3．2．3 基因克隆

3．2．4 过表达载体的构建

3．2．5 水稻的转基因方法

3．2．6 转基因植株的鉴定

3．3．1 基因表达分析

3．3．2 ZmNdhL1基因的克隆及序列分析

3．3．3 ZmNdhL1基因表达载体的构建

3．3．4 ZmNdhL1基因转水稻

3．3．5 转基因水稻阳性植株检测

3．4 讨论与小结

第四章 ZmNdhL1超表达水稻的耐盐光合特性

4．1 前言

4．2．1 供试材料

4．2．2 育苗和盐处理

4．2．3 “鼓包”的测定

4．2．4 诱导曲线的测定

4．2．5 快速光响应曲线的测定

4．2．6 快速叶绿素荧光和延迟荧光曲线的测定

4．3．1 盐处理对ZmNdhL1超表达水稻株系与野生型叶片的影响

4．3．2 ZmNdhL1超表达水稻株系与野生型叶片作用光关闭后叶绿素荧光瞬间上升的情况分析

4．3．3 诱导曲线参数

4．3．4 快速光响应曲线

4．3．5 快速叶绿素荧光曲线

4．3．6 延迟荧光曲线

4．4 讨论和小结

全文总结

参考文献

附录

致谢

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