基因2b亚型猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定和疫苗研制

摘要

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的致病因子，对养猪业危害巨大。自2010年12月以来，中国各地猪群中暴发大规模的腹泻疾病，其特征是水性腹泻、呕吐、脱水和乳猪高死亡率。研究表明，该疫病是由强毒力的基因2b亚型（G2b亚型）PEDV变异株引起，该型毒株与经典疫苗株之间存在较大的抗原性差异，导致免疫保护效果不理想，因此迫切需要研制相应的疫苗用于该疫病的防控。
　　本研究从江苏某规模化猪场急性腹泻的哺乳仔猪小肠样品中分离到1株PEDV（命名为JSX2014株），该毒株通过细胞传代适应之后可在Vero细胞上稳定增殖并产生细胞病变(CPE)。采用RT-PCR方法对JSX2014株的全基因进行扩增并测序，运用MEGA5.05软件分析比较JSX2014株与其他PEDV毒株的全基因序列及S基因序列遗传进化关系，表明JSX2014毒株属于当前流行的G2b亚型。
　　本研究检测了G2b亚型PEDV JSX2014毒株在Vero细胞上以不同接毒量及接毒后不同时间点的病毒滴度，以确定该毒株的细胞适应毒株增殖规律。针对PEDV的N基因设计特异性引物，建立实时荧光定量方法，对增殖的JSX2014毒株进行定量。根据《中国兽药典》和《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》要求建立了JSX2014毒株的种子库，经RT-PCR检测未见外源病毒污染。利用Vero细胞转瓶培养工艺增殖JSX2014毒株抗原，浓缩后经甲醛灭活，添加氢氧化铝佐剂，制备了灭活疫苗。用该灭活疫苗免疫产前母猪及50日龄断奶仔猪，利用间接ELISA方法和血清中和试验分别检测疫苗免疫后的抗体消长规律。间接ELISA试验显示，断奶仔猪于免疫后14d已开始产生特异性抗体，免疫后42d表现100％血清抗体转阳。以JSX2014作为指示病毒进行中和实验，显示接种灭活JSX2014疫苗的断奶仔猪于免疫后42天表现最高血清抗体水平，与间接ELISA检测抗体增长规律相一致。免疫母猪分娩后7天的血清、初乳样品的中和抗体效价明显高于G1a型CV777毒株制备的灭活疫苗免疫组。综合所有实验结果本实验制备的JSX2014株灭活疫苗对PEDV G2b型毒株可以提供高效免疫保护。

目录

摘要

符号说明

第一章 猪流行性腹泻病毒研究进展

1 PEDV概述

1．1 PEDV的形态结构

1．2 PEDV的理化与培养特性

1．3 PEDV生物学分类

2．1 PEDV的基因组结构

2．2 主要编码的蛋白及其功能

3．1 PED在亚洲的流行

3．2 流行特点

3．3 临诊症状

3．4 发病机理

4 PEDV诊断技术

4．1 免疫电镜法(IEM)

4．2 免疫荧光法(IFA)

4．3 微量血清中和试验

4．4 RT-PCR法

4．5 ELISA法

5．1 组织灭活苗

5．2 细胞灭活苗

5．3 细胞弱毒苗

5．4 核酸疫苗

5．5 亚单位疫苗

第二章 基因2b亚型猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及基因序列分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．1 病毒的分离

2．2 病毒纯净性检测

2．3 TCID50滴定

2．4 间接免疫荧光(IFA)检测

2．5 PEDV基因组序列分析

3 讨论

第三章 JSX2014株细胞灭活苗的制备

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 JSX2014株在Vero细胞上增殖不同时间的比较

2．2 JSX2014株接毒量对病毒在Vero细胞中增殖的影响

2．3 间接ELISA检测方法的建立

2．4 JSX2014株细胞灭活苗抗体效价评估

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢

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