银杏种子休眠过程与休眠解除研究

摘要

银杏(Ginkgo biloba L.)是现存最古老的裸子植物之一，银杏种子具有重要的经济价值，但银杏种子休眠过程和休眠解除机理还不清楚。本论文以刚采收的银杏种子（9月份）、休眠中期种子(11月份)以及解除休眠（次年2月份）的种子为试验材料，分别对银杏种胚不同发育时期进行形态观察，尝试不同层积方式处理解除银杏种子休眠，对银杏种胚、胚乳进行植物内源激素含量测定，并利用高通量测序技术和生物信息学方法，深入研究银杏种子休眠过程与休眠解除。主要取得以下研究结果:
　　(1)定期拍摄9月份至次年2月份的银杏种胚长度及测定种胚重量发现，银杏种胚的长度和重量呈正比例上升趋势，9月种子成熟采收至10月，银杏种胚形态发育缓慢，胚较小约0.78cm，其组织结构不明显。到11-12月种胚开始迅速生长，平均长度1.2cm左右，形态变化明显，已发育形成较为完整的胚根、胚轴、胚芽和子叶。到次年2月种胚形态发育基本完成，子叶仍在生长。
　　(2)通过不同层积方式解除银杏种子休眠发现，室外自然沙藏层积中，随着层积时间增长，种子萌发率逐渐提高，但到层积90d和层积100d种子萌发率相近，其中层积100d达到42.9％，比对照组(干藏种子)35.77％高了19.93％。4℃低温层积4周后统计结果显示，层积50d和60d的种子萌发率相近，分别为36％和35.5％;而层积40d的种子萌发率与对照组（低温干藏）相比差别不大，约26.5％。说明50d以上的4℃低温层积可以提高种子萌发率。相比室外自然层积，4℃低温层积处理可缩短种子休眠时间。
　　(3)利用串联质谱仪分别对银杏种子休眠过程中的内源激素进行测定，结果发现种胚中的ABA在3个休眠阶段整体含量都较高，尤其11月种胚ABA相对含量最高，约570ng.g-1，到2月出现明显下降，约为365.6ng.g-1;种子休眠过程中的GA含量整体较低，9月种胚中的GA相对含量最低，约5.8ng.g-1，到2月种胚GA相对含量呈显著上升趋势，达到10.94ng.g-1;说明ABA在银杏种子休眠过程中起到主要维持休眠的作用。
　　(4)在9月(GES)、11月(GEN)、2月(GEF)种胚中分别获得13，292，093、13，404，160、14，141，212条原始序列，去除无插入片段、小于18nt短序列、polyA序列等低质量序列，最终得到12，749，995、13，026，297、13，664，058条高质量序列。文库中小RNA长度集中在18-24nt之间，在21、24nt处有峰值，符合典型miRNA长度分布。
　　(5)测序获得保守序列256条，比对miRBase数据库后，隶属49个miRNA家族。其中，miR156、miR159家族成员较多。预测获得198个新的miRNA，具有发夹结构。此外，以qvalue<0.01&|log2(foldchange)|＞1为标准，筛选差异表达的miRNA，共筛选出415个差异miRNA。通过9月、11月、2月种胚3个数据库比对，以9月为参照，11月vs9月(GEN vs GES)，筛选出90个差异miRNA;2月vs9月(GEF vs GES)，筛选出174个差异miRNA;以11月为参照，2月vs11月(GEF vs GEN)，筛选出151个差异miRNA。
　　(6)应用psRNATarget软件，对银杏种胚差异miRNA进行靶基因预测，已知miRNA预测得到1710个靶基因，新的miRNA预测得到1168个靶基因。通过GO富集分析发现，2月vs9月(GEF vs GES)差异miRNA的候选靶基因在生物学过程、细胞组分、分子功能上都有注释;11月vs9月(GEN vs GES)差异miRNA的靶基因在生物学过程、分子功能上有注释;2月vs11月(GEF vs GEN)差异miRNA的靶基因在生物学过程、细胞组分、分子功能上都有注释。通过KEGG富集发现，2月vs9月(GEF vs GES)差异miRNA的靶基因主要富集在生物合成、植物激素信号转导等途径;11月vs9月(GEN vs GES)差异miRNA的靶基因主要富集在代谢通路、植物激素信号转导等途径;2月vs11月(GEF vs GEN)差异miRNA的靶基因主要富集在生物合成、代谢等途径。
　　(7)基于以上对种胚休眠差异miRNA及其靶基因富集分析，并结合银杏基因组和种胚转录组数据以及靶基因功能注释，进一步重点分析种胚发育和激素信号相关miRNAs在不同休眠阶段的表达模式。其中，与种胚发育相关miRNAs，如miR156家族的表达水平较高，miR156a先下降后上升，miR156b整体呈上升趋势，表达水平都在2月最高。miR156的预测靶基因为Gb_27198（功能注释为SPL基因）在种胚3个休眠阶段表达水平呈下降趋势，与miR156b的表达模式相反。与激素信号相关miRNAs，如miR159家族在种胚休眠前两个阶段变化不大，第3个阶段明显下降趋势。miR159的预测靶基因为Gb_02586(功能注释为MYB基因)在种胚3个休眠阶段的表达水平呈上升趋势，与miR159的表达模式基本相反。此外，还利用Cytoscape软件技术平台构建差异表达的关键miRNAs及其靶基因的互作调控网络。结果发现，同一个miRNA存在多个靶基因，同时有些miRNAs还有唯一靶向的靶基因，也存在共同的靶基因。
　　(8)分别对6个已知miRNA(miR156a、miR156b、miR159a、miR166c、miR164a、miR172a)和2个新的miRNA(novel_miR89、novel_miR141)的前体序列及部分靶基因进行荧光定量实验，进一步验证银杏种胚中miRNA及靶基因在种胚发育3个时期的表达模式，验证结果与sRNA-Seq表达趋势基本保持一致，说明测序结果可信。
　　综上所述，本研究对银杏种子休眠过程中的种胚的形态变化、生理指标测定、不同层积方式解除种子休眠以及小RNA组学进行全面地分析，为研究银杏种子休眠过程与休眠解除提供一定的理论参考。

目录

摘要

英文缩写及中英文对照表

第一章 文献综述

1．种子休眠调控机制的研究进展

1．1 种子形态结构对休眠与萌发的影响

1．2 植物激素对种子休眠的调控作用

1．3 环境因子对种子休眠的影响

1．4 调控种子休眠的基因

1．5 关键miRNA在种子休眠过程中的功能

1．6 小结与展望

2．银杏种子休眠研究概况

3．本实验研究目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 银杏种胚形态观察及相关指标统计

2．2．1 实验仪器和软件

2．2．2 实验方法

2．3．1 实验仪器与试剂

2．3．3 实验方法

2．4 银杏种子休眠过程中的内源激素测定

2．4．1 实验仪器与试剂

2．4．3 实验方法

2．5 银杏种胚小RNA高通量测序及生物信息学分析

2．5．1 实验仪器与试剂

2．5．2 所需网站与软件

2．5．3 实验方法

2．6 荧光定量PCR

2．6．1 实验仪器与试剂

2．6．2 引物设计与合成

2．6．3 实验方法

第三章 结果与分析

3．1 银杏种子休眠过程中种胚形态观察及相关指标统计

3．2 银杏种子休眠解除处理

3．2．1 室外自然层积处理

3．2．2 4℃低温层积处理

3．3 银杏种子休眠过程中的内源激素含量变化

3．4．1 银杏种胚的small RNA文库总体分析

3．4．2 小RNA分类注释

3．4．3 生物信息学分析

3．4．4 miRNA和靶基因的qRT-PCR验证

第四章 讨论

4．2 层积解除种子休眠

4．3 小RNA文库分析

4．4 已知和新miRNAs及其靶基因分析

4．5 重要miRNAs及其靶基因功能与休眠的关系

总结

参考文献

致谢

在校期间主持的创新项目

在校期间申请发明的专利

在校期间参与发表的学术论文

声明