花生种子休眠解除过程中相关基因转录组学研究

摘要

花生是我国重要的油料作物和经济作物，单产、面积、出口均居世界前列。近年来我国花生在收获时期多逢阴雨天气，花生在植株上发芽现象严重，严重影响花生的产量、品质和种用质量，其主要根源是目前选育推广的花生新品种休眠性较弱。种子休眠性愈来愈成为花生重要的农艺性状，本研究筛选到强休眠的花生品种，并探讨了影响花生休眠性的主要因素，通过转录组学方法挖掘花生种子休眠解除过程以及萌发相关的候选基因，以阐明花生种子休眠向萌发转换的分子机制，研究结果为后续开展休眠功能基因研究、分子育种实践、培育适度休眠性的花生品种提供有价值信息。
　　主要研究结果如下:
　　1.不同花生品种（系）种子休眠性有差异，干种子发芽率变幅为0％～100％;强休眠品种花育52号鲜种子发芽率和干种子发芽率均为0％。内源激素分析表明，高水平内源ABA含量、低水平GA含量以及低GA/ABA比值对维持花生吸胀种子的休眠状态有积极作用。休眠态种子与乙烯利解除休眠种子相比较，乙烯利解除休眠种子的内源GA含量迅速上升，ABA含量下降，GA/ABA比值迅速上升。
　　2.利用RNA-seq技术对花生吸胀休眠态种子BO2(CK)、乙烯利处理吸胀休眠态种子2.5h AE1、种子露白AE2、种子萌发AE3四个不同时期的样品进行转录组测序，得到374006个长度大于200bp的转录本，大小471Mb;得到121412个Unigenes，大小94Mb。BO2(CK)，AE1，AE2，AE3四个文库中分别获得102845，104546，111535和110489Unigenes。通过与BO2(CK)相比较（Fold Change≥2 and Pvalue≤0.05），AE1中有1555个unigenes上调表达，472unigenes下调表达;AE2中有4586个unigenes上调表达，2335unigenes下调表达;AE3中有4192个unigenes上调表达，2967unigenes下调表达。筛选到四个样品中的共表达差异unigenes为1206个，通过聚类分析将差异表达unigenes聚类分成9组。其中赤霉素20氧化酶、脱落酸8'羟化酶、EREBP-like因子、ACC氧化酶、热激蛋白等综合调控花生种子休眠解除以及萌发。通过荧光定量进行了验证，证实转录组分析可靠。
　　3.通过转录组测序获得生长素抑制蛋白基因（AhARP），该基因全长为918 bp，基因开放阅读框为363 bp，编码121个氨基酸，推导出蛋白质分子量为13.44kD，理论等电点pI9.64。序列比对表明该序列与花生生长素抑制蛋白基因(AAZ20292.1)一致。荧光定量PCR结果表明，AhARP基因在种子休眠阶段表达量较高，种子休眠解除后表达量降低;乙烯利解除吸胀种子休眠过程中，AhARP基因受到明显诱导;说明AhARP基因可能与花生种子休眠有关。
　　4.基于转录组分析结果，检测到15个与GA、40个与ABA、60个与ETH、56个与auxin相关的unigenes在花生种子休眠解除过程中表现显著差异表达。荧光定量PCR结果显示，ABA合成关键基因AhNCED2和代谢关键基因AhCYP707A1在种子休眠解除过程中均受外源乙烯利诱导，表达差异显著;在休眠和无休眠种子吸胀萌发过程中，AhNCED2和AhCYP707A1的表达趋势不同，AhNCED2对于种子休眠维持发挥积极作用，而AhCYP707A1对于种子休眠解除发挥积极作用。获得了乙烯合成途径中的关键基因AhACO1，GeneBank中登录号为KP298003。荧光定量PCR结果表明AhACO1基因受到乙烯利诱导表达;休眠种子吸胀过程中AhACO1下调表达，无休眠种子吸胀萌发过程中AhACO1上调表达，推测AhACO1可能与花生种子萌发密切相关。
　　5.获得与花生种子萌发相关的基因AhSGR，该基因编码未知蛋白，在44-122AA处含有DOG1保守结构域，分子量33.39kD，等电点为5.04，定位于细胞核内，未发现信号肽及其剪切位点，推测AhSGR可能是转录因子。荧光定量检测表明该基因与花生种子萌发密切相关。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 花生产业现状及发展前景

2 种子的休眠与萌发

2．1 种子休眠与萌发的定义

2．2 种子休眠性分类

2．3 种子休眠的影响因素

2．4 种子休眠萌发的分子调控机制

3 转录组测序

4 花生种子休眠性研究

5 本研究目的意义

第二章 花生种子休眠性的影响因素

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 方法

1．3 数据分析

2 结果与分析

2．1 品种种子休眠性差异

2．2 种子休眠性与成熟度的关系

2．3 种子休眠性与贮藏温度的关系

2．4 种子休眠萌发过程中内源激素变化

3 讨论

3．1 花生品种休眠性的差异

3．2 影响花生种子休眠的因素

第三章 花生种子休眠解除转录组及验证分析

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 试剂

1．3 RNA的提取和质量检测

1．4 Illumina／Solexa转录组文库的构建与测序

1．5 转录组结果验证分析

1．6 数据处理

2 结果与分析

2．1 高质量RNA的提取和转录组文库的高效构建

2．2 RNA-seq序列分析和拼接组装

2．3 序列功能注释与功能分类

2．4 差异表达unigenes分析

2．5 花生种子转录组差异表达基因的验证

3 讨论

3．1 花生种子休眠解除转录组文库的构建

3．2 花生种子休眠解除过程相关基因的变化

第四章 花生种子休眠解除过程差异基因的分析

第一节 花生生长素抑制蛋白基因AhARP的表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 花生种子休眠解除过程与激素相关基因的表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 花生种子萌发基因AhSGR的表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 全文总结

1 全文结论

1．1 花生种子休眠性的影响因素

1．2 花生种子休眠解除转录组及验证分析

1．3 花生种子休眠解除过程差异基因的分析

2 本研究的创新之处

参考文献

附录

在读期间发表和投稿论文

致谢