水稻Wx基因第10外显子单碱基变异位点SNP10C/T效应分析

摘要

水稻胚乳中直链淀粉含量是影响稻米品质最主要的因素，而其主要受蜡质基因（Waxy，Wx）调控。Wx基因的等位变异是造成稻属中直链淀粉含量广泛变异的重要原因;挖掘并研究新的等位变异位点，可进一步揭示稻米品质形成及其变异的遗传机理，更可为稻米品质改良提供新的基因资源和途径。在前期的实验中，鉴定了一个控制稻米高直链淀粉含量但低淀粉粘滞性的Wx等位基因，Wxlsv。通过序列比对，发现Wxlsv与Wxa的编码区仅在第10外显子处存在一个单碱基C-T差异，将该单碱基变异位点命名为SNP10C/T。对其它已知Wx等位基因测序发现，只有Wxa在该位置处为T，其它Wx等位基因都是C，与Wxlsv相同。为明确此单碱基差异在稻米淀粉品质形成调控中的分子机理，开展了以下研究:
　　1、构建了Wxa与Wxlsv的功能验证表达载体，并转化糯稻Nip(wx)，与未转化对照Nip(wx)相比，转基因植株基本农艺性状没有受到影响，但是籽粒变得透明。Nip(wx)-Wxlsv与Nip(wx)-Wxa转基因稻米相比，表观直链淀粉含量显著提高，胶稠度下降，淀粉粘滞性显著降低。同时又将Wxlsv表达载体单独转化Nip(Wxa)，相较于对照Nip(Wxa)，Nip(Wxa)-Wxlsv转基因稻米的直链淀粉含量上升，胶稠度变软，同时粘滞性也明显降低。以上结果证明了SNP10C/T是造成Wxlsv高直链淀粉含量、低淀粉粘滞性的关键突变。
　　2、对不同背景下Wx基因的近等基因系进行分析，发现Wxlsv与Wxa在转录水平和翻译水平上无明显差异，但Wxlsv编码的GBSSⅠ的酶活要显著高于Wxa编码的GBSSⅠ;通过同源建模发现Wxlsv与Wxa第10外显的C-T差异所导致的氨基酸替换并没有造成编码的GBSSⅠ蛋白二级结构的改变;磷酸化测序发现，Wxa编码的GBSSⅠ的第415位丝氨酸残基存在磷酸化修饰，而Wxlsv编码的GBSSⅠ的第415位脯氨酸则未被修饰，说明SNP10C/T导致的GBSSⅠ第415位脯氨酸-丝氨酸的替换可能改变了磷酸化修饰的水平，从而调控了GBSSⅠ的酶活，进而影响了稻米的理化品质。
　　3、为探究SNP10C/T在其它Wx等位基因中对稻米品质的效应，构建了Wxmp、Wxb与Wxin的表达载体，以及各自第10外显子第115位碱基定点突变成T的表达载体Wxmp-10T，Wxx-10T与Wxin-10T，转化Nip(wx);稻米理化品质分析发现该SNP在三种不同背景下都会造成直链淀粉含量的下降，从而影响籽粒的透明程度，但下降的幅度因背景而异;在Wxmp、Wxb这两类极低直链淀粉、低直链淀粉类型的Wx基因背景下，该SNP会造成淀粉粘滞性的降低，但在Wxin这种中间型或者Wxlsv这种高直链淀粉类型的Wx基因背景下，该SNP却会导致淀粉粘滞性的升高。

目录

摘要

符号说明

1 文献综述

1．1 稻米的蒸煮与食昧品质

1．1．1 直链淀粉含量

1．1．2 胶稠度

1．1．3 糊化温度

1．1．4 淀粉粘滞性

1．2 水稻蜡质基因Wx

1．2．1 Wx基因的等位变异类型

1．2．2 Wx基因的表达调控

1．2．3 Wx等位基因在育种中的应用

1．3 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 质粒DNA的提取、酶切、连接与转化

2．3 DNA的克隆与序列分析

2．4 功能验证载体的构建

2．5 根瘤农杆菌介导的水稻转化

2．6 转基因水稻的检测

2．7 稻米样品的前处理

2．8 稻米品质的测定

2．8．1 表观直链淀粉含量的测定

2．8．2 胶稠度的测定

2．8．3 RVA谱的测定

2．8．4 食味值的测定

2．9 淀粉的提取

2．10 淀粉的去脂

2．11 水稻胚乳总RNA提取

2．12 第一链cDNA的获得

2．13 实时荧光定量RT-PCR

2．15 GBSSⅠ蛋白的磷酸化测序

2．17 GBSSⅠ蛋白的同源建模

2．18 稻米及淀粉体外消化特性的测定

2．19 统计分析

3 结果与分析

3．1．2 T0代转基因植株的鉴定

3．1．3 转基因水稻纯系的筛选

3．1．4 转基因植株表型分析

3．1．5 Wx基因在转基因水稻胚乳中的表达分析

3．1．6 转基因稻米成熟种子中蛋白水平表达分析

3．1．7 转基因稻米理化品质的测定

3．1．8 转基因稻米淀粉粘滞性比较

3．2 利用近等基因系分析SNP10C/T对稻米品质的效应

3．2．1 不同背景下近等基因系的构建及鉴定

3．2．2 近等基因系稻米理化品质分析

3．2．3 近等基因系淀粉消化速率分析

3．3．1 Wx基因转录水平表达分析

3．3．2 蛋白水平表达分析

3．3．3 GBSSⅠ酶活比较

3．3．4 GBSSⅠ蛋白结构及磷酸化位点分析

3．4 SNP10C/T在其它Wx等位基因背景下对稻米品质的效应

3．4．1 转基因材料的创建与鉴定

3．4．2 SNP10C/T在Wxmp背景下的效应

3．4．3 SNP10C/T在Wxb背景下的效应

3．4．4 SNP10C/T在Wxin行背景下的效应

4 小结与讨论

4．1 小结

4．2 Wx基因SNP10C/T的效应分析

4．3 Wxlsv与SNP10C/T在育种中的应用前景

4．4 研究展望

参考文献

致谢

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