抑制淀粉分支酶表达引起水稻胚乳异形淀粉形成的酶学基础

摘要

国内外的研究表明，抑制淀粉分支酶(SBE)表达可以提高禾谷类作物胚乳直链淀粉和抗性淀粉含量，具有促进人体健康的作用。然而伴随直链淀粉含量不同程度的增加，胚乳形成不同形态的淀粉粒（被称为异形淀粉）。这些异形淀粉的淀粉组分、晶体结构和理化特性具有明显差异，并在胚乳中呈区域性分布，但它们的形成机制及其胚乳区域性分布的原因尚未澄清。本研究以来源于水稻品种特青(TQ)抑制SBEⅠ/Ⅱb表达的高直链抗性淀粉水稻TRS为材料，在胚乳发育过程中，研究TRS胚乳多角形、多聚体、细长形和中空状等异形淀粉在发育籽粒中的时空积累和淀粉组分变化，分析淀粉合成关键酶的转录、表达和活性，调查SBE在籽粒中的区域性分布，从而揭示抑制SBE表达引起胚乳异形淀粉形成的酶学基础。研究结果不仅为高直链抗性淀粉禾谷类作物的培育提供帮助，而且丰富和充实植物淀粉的形成和发育等知识。主要研究结果如下:
　　1.异形淀粉在发育籽粒中的时空积累。完整籽粒的切片观察表明，TRS胚乳含有多角形、多聚体、细长形和中空状等异形淀粉。多角形淀粉为复粒淀粉的亚颗粒，从花后4d开始形成，主要在TRS胚乳中央区域积累。多聚体和细长形淀粉从花后7d开始形成，主要在中间胚乳中积累。中空状淀粉从花后10d开始形成，主要在外围亚糊粉层区域积累。
　　2.异形淀粉的淀粉组分。发育籽粒内的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量分析表明，花后7d之后，TRS籽粒内的支链淀粉和总淀粉含量显著低于TQ，而直链淀粉含量明显高于TQ，并且支链淀粉含量降低的幅度比直链淀粉含量升高的幅度大。因此，与TQ相比，TRS粒重降低和分离淀粉中的直链淀粉含量的升高主要是支链淀粉在籽粒内的合成受阻造成的，同时直链淀粉在籽粒内的合成增加进一步提高了分离淀粉的直链淀粉含量。分离淀粉及其支链淀粉的淀粉分子量分布测定表明，TRS多角形、多聚体、细长形和中空状淀粉的真实直链淀粉含量依次为26.1％、38.3％、62.4％和74.9％，支链淀粉分支度依次降低，但它们的支链淀粉超长链含量反而比TQ淀粉低。支链淀粉链长分布测定显示，从TRS多角形、多聚体、细长形到中空状淀粉，支链淀粉短支链含量逐渐降低，而长支链和支链平均链长逐渐增加。
　　3.淀粉合成关键酶的转录、表达和活性动态。发育胚乳的qRT-PCR、免疫印迹和Native-PAGE/活性染色的结果表明，与TQ相比，TRS中的SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb的转录、表达和活性均被显著抑制，可溶性淀粉合成酶SSSI活性降低，淀粉磷酸化酶Pho1表达增强，而其它支链淀粉合成关键酶没有显著变化。淀粉粒绑定蛋白的分析结果表明，从TRS多角形、多聚体、细长形到中空状淀粉，SBEⅠ、SBEⅡa、SBEⅡb和SSSI的含量逐渐降低，而Pho1含量逐渐升高，但颗粒结合淀粉合成酶GBSSI的转录、表达和活性在TQ和TRS之间及各TRS异形淀粉之间没有明显差异。
　　4.SBE在籽粒中的区域性分布。花后10d籽粒的免疫荧光分析表明，SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb在TQ胚乳中表现均质分布，而在TRS胚乳中表现出特定的空间分布，荧光信号强度从胚乳的内部向外部逐渐减弱。
　　上述结果表明，TRS胚乳中SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb的表达抑制减少了支链淀粉的合成，从而在淀粉粒内释放出更多的空间供直链淀粉合成和积累。SBE剂量影响淀粉中的支链淀粉含量和结构及直链淀粉含量，进一步改变淀粉粒的形态。SBE表达在TRS发育籽粒中从胚乳内部到外部逐渐降低，导致多角形、多聚体、细长形和中空状淀粉依次在TRS籽粒中从胚乳内部到外部逐渐形成和积累。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 淀粉概述

1．1 淀粉组成和结构

1．2 淀粉合成

2 高直链淀粉禾谷类作物研究进展

2．1 高直链淀粉禾谷类作物培育的意义

2．2 高直链淀粉禾谷类作物的创建

2．3 高直链淀粉禾谷类作物胚乳淀粉的分子结构

2．4 高直链淀粉禾谷类作物胚乳淀粉的理化性质

2．5 高直链淀粉禾谷类作物胚乳异质淀粉粒研究

3 本论文拟解决的问题、研究目的和意义

第二章 抑制淀粉分支酶表达引起水稻胚乳异形淀粉形成的酶学基础

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 完整颖果树脂切片及其染色和观察

2．3 胚乳淀粉和异形淀粉粒的分离

2．4 直链淀粉和支链淀粉含量测定

2．5 胚乳可溶性糖含量测定

2．6 淀粉分子量分布和支链淀粉链长分布测定

2．7 胚乳RNA的提取和反转录

2．8 胚乳蛋白质的提取

2．9 淀粉合成关键酶的免疫印迹

2．10 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳／活性染色

2．11 GBSSⅠ酶活性测定

2．12 籽粒石蜡包埋和切片

2．13 免疫荧光分析

2．14 统计分析

3 结果与分析

3．1 四种异形淀粉粒在TRS发育胚乳中的动态积累

3．2 发育籽粒中的可溶性糖、直链淀粉和支链淀粉含量变化

3．3 TRS胚乳中四种异形淀粉粒的分离纯化

3．4 TRS胚乳四种异形淀粉粒的分子结构

3．5 SBEⅠ和SBEⅡb表达降低对其他淀粉合成相关酶的影响

3．6 TRS中支链淀粉合成关键酶在淀粉粒中的积累动态

3．7 淀粉粒绑定酶蛋白在TRS四种异形淀粉粒中的分布情况

3．8 SBE在TRS发育胚乳中的区域性分布

3．9 淀粉分子组成和SBE蛋白剂量的相关性

3．10 中花11ae突变体成熟胚乳异形淀粉的区域性分布

4 讨论

4．1 支链淀粉合成减少引起淀粉粒内部空间扩大是直链淀粉大量积累的关键因素

4．2 TRS胚乳中SBE逐渐减少导致淀粉粒形态发生改变

4．3 TRS籽粒中SBE区域性分布的原因

4．4 淀粉粒结合支链淀粉合成关键酶是支链淀粉分子结构的重要指标

5 小结

结论与创新点

参考文献

附录

致谢

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