猪圆环病毒3型回顾性调查与cap蛋白单克隆抗体的研制

摘要

2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，在患有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍的母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型(Porcine circovirus3，PCV3)。流行病学调查发现PCV3感染多见于具有PDNS和繁殖障碍症状猪群，目前已在美国多个州猪群内普遍流行。同时，美国旧金山市血液系统研究所的研究人员从3头不明病因导致的心脏和多器官炎症仔猪体内也检测出PCV3。随后，我国湖北、广东等多个省市猪群中也检测出PCV3。猪圆环病毒3型在全球范围内已经普遍流行，快速、准确地诊断猪群的感染状况对防控本病具有重要的意义。
　　本文通过对2008-2017年由本实验室保存的江苏省部分地区141个养殖场的272份疑似猪圆环病毒病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)的患病猪临床样品进行PCV3回顾性调查;利用PCR技术或RT-PCR技术对组织样品中PCV2、PCV3、PPV、PRV、CSFV和PRRSV各等病毒的混合感染情况进行检测。结果40份样品鉴定为PCV3阳性，占总数的14.7％(40/272);同时测定出4株PCV3的全基因序列。结果表明，2013至2017年间PCV3在江苏部分地区猪群中已普遍存在。
　　本文将PCV3Cap蛋白的去核定位信号肽基因插入原核表达载体pET-28a中，经IPTG诱导表达，产生了具有免疫原性的融合蛋白。经表达条件的优化，表达的蛋白仍以包涵体形式存在。经尿素变性、透析复性、阳离子交换柱纯化后的蛋白作为免疫原，免疫6周龄的BALB/c母鼠，再经细胞融合、间接ELISA筛选、亚克隆后获得1D3-6-25、1D3-11-39、1D3-5-10、1D3-32-61等8株能够稳定分泌针对PCV3Cap蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。Western Blot与IFA试验结果表明，8株单抗都能对相应的蛋白特异性识别。从8株单抗中，挑选3株制备腹水(1D3-14-57、1D3-29-72、1D3-11-39);经间接ELISA的方法确定阳性反应的最高稀释倍数即为其效价，3株单抗的腹水效价分别为1∶409600、1∶204800和1∶409600。选用野外感染PCV3毒株的猪腹股沟淋巴结做免疫组化，未免疫小鼠的血清作为阴性对照;同时，将单抗腹水稀释1000倍后作为一抗，1∶8000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，鉴定单抗特异性。结果显示3株单抗的腹水均具有较好的反应性。

目录

摘要

符号说明

1 猪圆环病毒研究进展

2 PCV流行病学

3 PCV3临床症状与病理变化

4 与PCV3的相关疾病

5 诊断方法

6 单克隆抗体技术

7 研究目的及意义

第一章 2008-2017年江苏部分地区猪圆环病毒3型回顾性调查及系统进化分析

1 材料

1．1 试剂与仪器

1．2 分子生物学软件

1．3 引物设计与合成

2 方法

2．1 病料的采集与处理

2．2 病毒DNA的提取

2．3 RNA的提取与反转录

2．4 病毒的PCR检测

2．5 PCV3的全基因组的扩增与测序

2．6 序列分析

3 结果与讨论

3．1 六种病毒的PCR或RT-PCR产物的电泳与PCV3全基因组的分段测序

3．2 PCV3回顾性调查结果

3．3 PCV3混合感染结果

3．4 PCV3全基因组、cap基因、rep基因的遗传进化树

3．5 讨论

参考文献

第二章 猪圆环病毒3型cap蛋白单克隆抗体的研制与鉴定

1 材料

1．1 病毒、细胞系、载体、菌株以及实验动物

1．2 主要试剂

1．3 仪器设备

1．4 相关溶液的配制

1．5 分子生物学软件

2 免疫原的制备

2．1 病料的来源与处理

2．2 引物设计与合成

2．3 目的基因的扩增

2．4 胶回收PCR产物及T载体连接反应

2．5 转化

2．6 重组质粒的提取与鉴定

2．7 重组质粒T-PCV3-cap的序列测定

2．9 蛋白的表达及纯化

3 单克隆抗体的制备

3．1 动物免疫

3．2 细胞融合

3．3 杂交瘤细胞的筛选

3．4 杂交瘤细胞的亚克隆

3．5 杂交瘤细胞的冻存和复苏

3．6 单抗特异性鉴定

3．7 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定

3．8 腹水的制备

3．9 单克隆抗体在免疫组化试验中的运用

4 结果

4．1 目的基因的PCR扩增产物

4．2 重组质粒(T-PCV3-cap)的双酶切鉴定

4．3 重组质粒(pET-28a-PCV3-cap)的双酶切鉴定

4．4 目的蛋白的SDS-PAGE鉴定

4．5 重组蛋白小量诱导表达条件优化及可溶性分析

4．6 纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定

4．7 杂交瘤细胞株的建立

4．8 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定

4．9 单抗腹水效价测定及亚类鉴定

4．10 单克隆抗体在免疫组化试验中的初步应用

5 讨论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

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