H5N8亚型禽流感病毒PB2蛋白对小鼠高致病性分子标记的鉴定及致病机制研究

摘要

自1996年首次在广东的鹅体内分离鉴定出H5N1亚型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)A/Goose/Guangdong/1/1996(Gs/GD/1996)以来，该亚型病毒一直在我国存在，感染野禽和家禽。H5亚型高致病性AIVs除引起家禽的高发病率和死亡率外，还可以偶尔跨种间传播引起人的高病死率。近年来H5N1病毒与多个不同亚型的神经氨酸酶基因重配为新型H5Nx病毒（包括H5N2、H5N6及H5N8等），其中H5N8亚型AIVs地理分布广泛。因此，了解新出现的H5N8病毒对哺乳动物的致病性并鉴定出高致病性分子标记对该病毒的预测预警具有重要意义。
　　本研究中，我们筛选出2株遗传背景相似但对小鼠致病力存在显著差异的H5N8AIVs，测定了其生物学特性，并解析了导致2株病毒致病力差异的分子机制及宿主因素。
　　1.对小鼠致病力存在差异的H5N8亚型AIVs的筛选及生物学特性的测定
　　对实验室2012-2014年间分离的不同宿主来源的10株H5N8AIVs进行小鼠致病力测定，并从中筛选出2株对小鼠致病力有显著差异的病毒A/goose/Eastern China/CZ/2013(CZ)和A/duck/Eastern China/JY/2014(JY)作为模式病毒。HA基因遗传进化及基因组差异分析表明2株模式病毒同属2.3.4.4分支，全基因组仅存在25个氨基酸差异。受体结合能力测定表明，2株病毒都具有α-2，3及α-2，6双受体结合特性。体外病毒生长动力学表明，2株病毒在CEF细胞上均能有效复制，滴度可达到约8log10TCID50/mL;而在MDCK细胞上，CZ病毒可以有效复制，最高滴度约为7log10TCID50/mL;JY病毒生长受限，最高滴度小于4log10TCID50/mL。动物试验结果表明，2株病毒虽然对SPF鸡来说都是高致病性的，对小鼠的致病性却不同。CZ对小鼠是高致病性的(MLD50=101.6EID50)，JY对小鼠则是低致病性的(MLD50＞106.5EID50)。
　　2.PB2蛋白283M和526R协同作用增强H5N8亚型AIVs对小鼠的致病力
　　分别以CZ和JY为骨架构建了一系列单基因替换重组病毒并测定其对小鼠的致病力。结果显示，当CZ病毒骨架中替换入JY病毒PB2、PB1和PA基因后，病毒对小鼠的毒力明显降低;然而，JY骨架中只有替换入CZ病毒PB2基因后(JY-CZPB2)，病毒对小鼠的毒力才有所增强。通过对模式病毒PB2基因上差异氨基酸的相互定点突变，我们证明了PB2283M及526R增强了病毒的聚合酶活性、在哺乳动物细胞(MDCK)上的复制效率以及对小鼠的致病性。进一步试验证实这2个氨基酸在H5N1亚型AIV中也发挥相同的作用。因此，283位甲硫氨酸(M)是H5N8亚型AIVs中一个新的哺乳动物致病力分子标记，且其同526位精氨酸(R)协同作用是导致H5N8病毒对小鼠高毒力的关键因素。
　　3.H5N8病毒PB2蛋白I283M及K526R突变增强病毒对小鼠致病力的宿主因素分析
　　母本病毒r-JY以及突变病毒JYPB2-I283M-K526R感染小鼠3d后，采集样品利用RNA-seq的方法分析宿主（小鼠肺脏）和病原体的双转录组水平。结果显示，JYPB2-I283M-K526R感染组中宿主显著性差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)的转录本数目以及表达水平均高于r-JY感染组。GO富集分析表明，r-JY感染组DEGs的功能主要与应激应答、防御应答以及免疫应答相关，而JYPB2-I283M-K526R感染组DEGs的功能主要与应激应答、免疫系统过程以及蛋白结合相关，且突变病毒组免疫相关基因的富集数是母本病毒组的4倍左右。基因表达热图显示，突变病毒感染组的大部分免疫应答相关基因的表达水平显著高于母本病毒感染组，暗示突变病毒可以在小鼠肺脏中诱导过激的天然免疫应答。此外，相比于r-JY以及健康对照组，JYPB2-I283M-K526R可以在感染后3d诱导小鼠肺脏更强烈的细胞凋亡。病毒转录组序列分析显示突变病毒感染组小鼠肺脏中病毒基因的表达水平显著高于母本病毒感染组，这与突变病毒感染小鼠后其肺脏中检测出更高的病毒滴度相一致。
　　综上所述，PB2蛋白283M及526R的协同作用是增强H5N8病毒对小鼠致病力的分子基础。此外，CZ病毒对小鼠的高致病性与其诱导的异常宿主天然免疫应答相关。

目录

论文说明

摘要

符号说明

主要仪器设备

综述

第一章 对小鼠致病力存在差异的H5N8亚型禽流感病毒的筛选及生物学特性的测定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 PB2蛋白283M和526R协同作用增强H5N8亚型禽流感病毒对小鼠的致病力

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 H5N8病毒PB2蛋白I283M及K526R突变增强病毒对小鼠致病力的宿主因素分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

声明