新城疫病毒HN蛋白抗原差异分析及基因Ⅶ型HN E347K变异株重组活疫苗LX/AI4-347K的研制

摘要

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)强毒引起的一种烈性传染病。NDV只有一个血清型，但有多个基因型，目前我国NDV优势流行基因型为Ⅶd亚型。NDV表面糖蛋白血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-Neuraminidase，HN)是NDV的主要表面抗原之一，具有良好的免疫原性。HN蛋白在免疫压力下易发生抗原变异，单克隆抗体技术已广泛用于HN蛋白部分线性和构象抗原表位鉴定和抗原性分析，分析流行株抗原表位的变异对ND疫苗的设计具有重要意义。目前生产过程中急需毒力低可以胚内接种或1日龄气雾免疫的与优势流行株基因型和抗原性一致的活疫苗。为此我们利用实验室前期研究的单克隆抗体对目前优势流行基因Ⅶ型毒株HN的抗原表位的差异进行分析，利用反向遗传技术构建针对基因Ⅶ型347K变异株的重组活疫苗候选株，并对此疫苗候选株进行免疫效力评价。
　　1.NDV HN蛋白抗原变异分析
　　在免疫鸡群中常常发生非典型性新城疫，通常是由于疫苗株与流行株抗原性不匹配造成。利用实验室前期研究的单克隆抗体分析新城疫病毒的抗原差异，测定4株单克隆抗体与NDV各基因型参考株和流行株的反应性，并分析NDV各抗原区氨基酸变异频率。单抗与NDV毒株血清学反应和单抗表位鉴定结果表明，单抗5G8和M22可以与不同基因型所测毒株反应;单抗8C5针对的表位在370-572aa区域;1E5针对的抗原表位是347位氨基酸所在的线性表位区域，当毒株HN蛋白发生E347K或E347G变异时则不能与1E5反应。对2007-2015年95株基因Ⅶ型分离株HN蛋白的抗原表位氨基酸变异进行统计，结果表明在HN蛋白5大抗原区中，唯一线性表位所在抗原区345-353aa变异频率最高，为7.20％;其他表位变异频率都小于0.7％。HN蛋白线性表位及其旁侧基序(300-385aa)的变异分析结果表明共有6个位点发生变异，其中变异频率最高的是347位残基，变异率为65.26％;2011年以后的毒株大部分(43/62)发生E347K变异，引起HN蛋白抗原性的变化，从而导致常用疫苗如基因Ⅱ型La Sota(347E)保护性下降，导致免疫鸡群发生新城疫。因此，研制一株抗原性与流行株匹配的疫苗对控制非典型性新城疫具有重要意义。
　　2.基因Ⅶ型HN E347K变异株重组活疫苗LX/AI4-347K的构建
　　常用的新城疫商品化弱毒疫苗株为基因Ⅱ型La Sota株，其抗原性与流行株（基因Ⅶ型）不一致，致使免疫鸡群仍有ND发生，因此需要研制与流行株基因型和抗原性一致且安全性好的弱毒疫苗株。本研究以实验室前期构建的重组弱毒LX/AI4-MFHN作为骨架，利用反向遗传学技术，将E347K变异株的HN基因到LX/AI4-MFHN相应位置，构建并拯救出一株与当前NDV流行株抗原性更为接近的疫苗候选株LX/AI4-347K。该重组病毒LX/AI4-347K具有典型的弱毒特性(MDT＞120，ICPI=0.01)，且在鸡胚中繁殖滴度达到10917EID50/0.1mL。重组病毒LX/AI4-347K、疫苗株La Sota和亲本株LX分别免疫SPF鸡，免疫后第1周，LX/AI4-347K免疫组血清中HI抗体平均为4log2，略高于La Sota组（3.5log2），比LX组2个滴度;免疫后3周，LX/AI4-347K组鸡血清的HI抗体水平与La Sota组无明显差异，但比LX组高1个滴度。免疫后3周，用基因Ⅶ型E347K变异株JS-16-12-Ch攻毒，建立荧光定量PCR方法检测喉头、泄殖腔排毒和攻毒株在组织中的复制水平。攻毒后，3个免疫组的鸡均无死亡。LX/AI4-347K免疫组仅攻毒后第3天有2只鸡(2/8)喉头排毒，而La Sota免疫组鸡攻毒后第3天(4/8)和5天(2/8)喉头均有排毒，泄殖腔在第3天(3/8)排毒，LX免疫组在检测时间内均能检测到排毒，说明排毒水平有明显差异。攻毒后攻毒株在免疫鸡气管、肺、十二指肠和脾脏中复制水平:LX/AI4-347K组，在攻毒后第3天，有1只鸡(1/3)十二指肠和脾脏中有病毒复制;第5天，1只鸡(1/3)十二指肠中检测到病毒（平均CT值约32）;La Sota组，攻毒后第3和5天，病毒在所检测的脏器中都有复制，特别是攻毒后第5天，脾脏病毒检测率最高(3/3)，其次为气管(2/3)、十二指肠(2/3)和肺(1/3);LX组免疫后，攻毒株可在所检测的组织中复制，且病毒复制水平高。结果说明疫苗株LX/AI4-347K能够有效阻止泄殖腔的排毒，降低鸡群的呼吸道排毒率和排毒量，且在一定程度上缩短排毒时间;能够有效阻止攻毒株在气管、肺脏、十二指肠、脾脏中的复制，这些脏器的病毒载量显著低于La Sota和LX免疫组。

目录

摘要

符号说明

综述 新城疫病毒HN蛋白及新城疫疫苗研究进展

1 新城疫病毒概述

2 NDV流行情况概述

2．1 各国NDV流行概述

2．2 各基因型NDV流行概述

3 NDV HN蛋白研究进展

3．1 NDV HN蛋白的结构和功能

3．2 NDV HN蛋白抗原表位研究进展

3．3 新城疫HN蛋白的分子变异对疫苗保护性的影响

4．1 疫苗种类

4．2 疫苗使用状况

第一章 NDV HN蛋白抗原差异分析

1．1 质粒、鸡胚和细胞

1．2 主要仪器和试剂

1．3 分子生物学软件

2 实验方法

2．1 细胞复苏与冻存

2．2 腹水的制备

2．3 单抗基本生物学特性的鉴定

2．4 单抗与分离株的反应性

2．5 质粒构建、点突变及细胞转染

2．6 NDV HN蛋白抗原表位分析

3 结果

3．1 单抗基本生物学特性鉴定

3．2 单抗与NDV毒株的反应性

3．3 1E5与8C5针对的抗原表位的鉴定

3．4 HN蛋白抗原表位变异分析

4 讨论

第二章 基因Ⅶ型HN E347K变异株重组活疫苗LX／A14-347K的构建

1 材料

1．1 病毒、质粒与细胞

1．2 鸡胚和实验动物

1．3 分子生物学试剂和主要化学试剂

1．4 主要仪器

1．5 分子生物学软件

2 方法

2．1 引物设计

2．2 全长克隆构建

2．3 病毒拯救

2．4 获救病毒的鉴定

2．5 生物学特性测定

3．1 实验设计

3．2 检测指标和检测方法

4 结果

4．1 重组全长克隆构建、病毒拯救及遗传稳定性实验、生物学特性测定

4．2 荧光定量检测方法的建立

4．3 动物实验

5 讨论

参考文献

全文总结

致谢

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