分枝杆菌Hsp70对PCV2 Cap蛋白的免疫佐剂作用研究

摘要

猪圆环病毒2型(PCV2)是猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等猪病的主要病原。PCV2在世界范围内流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前PCV2防控主要依靠疫苗免疫，上市的疫苗有全病毒灭活苗、重组嵌合苗和亚单位疫苗，其中制备全病毒灭活苗所用病毒滴度较低，制备成本较高;大肠杆菌和昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产的亚单位疫苗工艺复杂、价格高昂，因此研制安全、高效的新型PCV2亚单位疫苗很有必要。
　　自聚肽ELK16能在大肠杆菌内形成活性包涵体，其融合蛋白可用离心洗涤法纯化。结核杆菌热应激蛋白70(Hsp70)是重要的病原相关分子模式，通过Toll样受体2(TLR-2)刺激先天性免疫细胞，释放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10和IL-12等细胞因子具有免疫佐剂作用。本研究以自聚肽ELK16为纯化标签，用于PCV2Cap蛋白和结核分枝杆菌Hsp70的融合表达和纯化，旨在简化PCV2亚单位疫苗和Hsp70分子佐剂的制备工艺。进而以小鼠为动物模型，评价分子佐剂对候选亚单位疫苗的免疫佐剂作用，为PCV2新型亚单位疫苗研制奠定基础。
　　以自聚肽ELK16为纯化标签，分别与结核分枝杆菌Hsp70和PCV2Cap基因融合，在重组大肠杆菌中进行诱导表达。在优化条件下，利用离心洗涤法进行融合蛋白纯化，获得了纯化的融合蛋白ELK16-Cap、ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70，其纯度高达95％、96％和85％，产量分别为92mg/L、84mg/L和83mg/L细菌培养。分别用ELK16-Cap、ELK16-Cap+弗氏不完全佐剂(IFA)、ELK16-Cap+ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70免疫小鼠，设PBS对照组。初免后7、14、21和28天采血分离血清，用间接ELISA进行抗体检测，结果显示:在初免后7天，IFA+ELK16-Cap和ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组即为ELISA抗体检测阳性，其他三组为特异抗体阴性;从初免后14天开始，四个免疫组的抗体水平呈逐渐上升趋势，其中ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组抗体水平最高，IFA+ELK16-Cap免疫组次之，ELK16-Cap免疫组抗体水平最低;从初免后21天开始，四个免疫组的抗体水平进一步上升，ELK16-Cap-Hsp70免疫组抗体水平最高，ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组抗体水平次之，ELK16-Cap免疫组抗体水平最低。在二免后两周取免疫小鼠脾脏淋巴细胞，用试剂盒检测细胞因子表达。结果显示:PBS对照组、ELK16-Cap免疫组、ELK16-Cap+IFA免疫组、ELK16-Hsp70+ELK16-Cap免疫组和ELK16-Cap-Hsp70免疫组的TNF-α浓度分别为588.55、802.55、995.55、1382.55和1719.55pg/mL，IFN-γ浓度分别为46.30、92.22、155.56、470.37和518.15pg/mL，IL-12浓度分别为14.72、28.06、20.83、31.39和34.72pg/mL。这些研究结果表明，分子Hsp70对刺激PCV2Cap蛋白ELISA抗体产生的作用优于IFA，但两者融合蛋白的刺激作用较强;与Cap蛋白融合的Hsp70对刺激TNF-α、IFN-γ和IL-12产生的作用较强，而ELK16-Hsp70+ELK16-Cap对三种细胞因子产生的刺激作用次之。
　　为了优化PCV2重组抗原的抗原性，将His标签与PCV-2a、PCV-2d、PCV-2e中和表位和PCV-2b Cap基因进行融合表达，并将结核分枝杆菌Hsp70基因与4Cap-His进行融合表达，利用亲和层析法纯化得4Cap-His、Hsp70-His和4Cap-hsp70-His融合蛋白。将30只小鼠分为5组，分别为PBS对照组、4Cap-His免疫组、4Cap-His+Hsp70-His免疫组、4Cap-hsp70-His组和4Cap-His+IFA免疫组。初免后7和14天采血，用间接ELISA测定Cap蛋白特异抗体;在二免后14天取免疫小鼠脾淋巴细胞，用试剂盒测定细胞因子浓度。每组三只免疫小鼠用2×103TCID50PCV2b攻毒，第3和7天采血分离血清，用定量PCR检测病毒血症。结果显示:在初免后第七天，4Cap-His+Hsp70-His和4Cap-hsp70-His即为ELISA抗体检测阳性，其他三组为抗体检测阴性;初免后14天，对照组和4Cap-His免疫组仍为抗体检测阴性，4Cap-His+IFA免疫组为抗体检测阳性，但低于4Cap-hsp70-His免疫组;从初免后21天，四个免疫组的抗体水平明显上升，其中4Cap-hsp70-His免疫组的抗体水平最高。与对照组相比，四个免疫组的TNF-α、IFN-γ和IL-12表达水平明显上升，并高于刀豆蛋白A刺激组。与对照组相比，所有含4Cap重组蛋白的免疫组血清中病毒载量均呈降低趋势，攻毒后7天比3天明显下降，4Cap-hsp70-His免疫组病毒载量下降最多，4Cap-His+Hsp70-His免疫组次之，4Cap-His免疫组病毒载量下降最低。这些研究结果表明，ELK16标签对Hsp70刺激PCV2Cap蛋白ELISA抗体产生无明显影响，两种方式融合Hsp70的体液免疫刺激作用优于IFA，均能刺激小鼠产生TNF-α、IFN-γ和IL-12表达，并且Hsp70融合PCV2Cap蛋白的刺激作用较强。

目录

摘要

符号说明

综述一：猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗研究进展

1．概述

2．流行病学概况

3．PCV2疫苗

4．传统疫苗

4．1 灭活疫苗

4．2 减毒活疫苗

5．新型疫苗

5．1 活载体疫苗

5．2 核酸疫苗

5．3 重组嵌合病毒疫苗

5．4 亚单位疫苗

6．猪圆环病毒病的防控

参考文献：

综述二：热休克蛋白的生物学功能研究进展

1．热休克蛋白的分类

2．热休克蛋白的结构

3．热休克蛋白的功能

3．1 分子伴侣

3．2 细胞凋亡

3．3 增强细胞抗逆性

3．4 免疫应答

参考文献：

研究内容一：分枝杆菌HSP70对PCV2 Cap蛋白的免疫应答研究

1．材料

1．1 试剂

1．2 生物材料

1．3 实验动物

1．4 主要溶液与培养基

1．5 仪器与设备

2．方法

2．1 表达载体的构建

2．2 融合蛋白表达与分析

2．3 融合蛋白分离纯化

2．4 Western Blot鉴定

2．5 小鼠免疫程序

2．6 ELlSA抗体检测

2．7 细胞因子检测

3．结果

3．1 融合表达载体鉴定

3．2 融合蛋白表达分析

3．3 类包涵体离心力优化

3．4 融合蛋白纯化

3．5 Westem Blot鉴定

3．6 小鼠免疫抗体测定

3．7 细胞因子测定

4．讨论

参考文献：

研究内容二：分枝杆菌HSP70对多价PCV2 Cap抗原的免疫应答研究

1．材料

1．1 试剂

1．2 生物材料

1．3 实验动物

1．4 主要溶液

1．5 仪器与设备

2．1 表达载体的构建

2．2 融合蛋白表达与分析

2．3 融合蛋白分离纯化

2．4 Western Blot鉴定

2．7 细胞因子检测

2．8 免疫小鼠攻毒保护

3．1 融合表达载体鉴定

3．2 融合蛋白表达分析

3．3 融合蛋白纯化

3．4 Western Blot鉴定

3．5 小鼠免疫抗体测定

3．6 细胞因子含量测定

3．7 免疫小鼠攻毒保护

4．讨论

参考文献

全文总结

致谢

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