西花蓟马温度耐受性研究及其热激蛋白70基因的克隆与表达

摘要

西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)，隶属缨翅目Thysanoptera，蓟马科Thripidae，花蓟马属Frankliniella，是世界性的观赏植物和经济作物上的重要害虫。在全球气候变暖的大背景下，西花蓟马在全球范围内迅速入侵和扩散。为研究温度对西花蓟马的入侵、分布及种群动态的影响，本研究在实验室条件下对恒温饲养条件的西花蓟马进行高低温胁迫处理，比较分析西花蓟马长期饲养前后的温度耐受性变化;对受温度胁迫后的西花蓟马进行转录组测序，从转录组中获取HSP70(Heat Shock Protein70，HSP70)基因，对其进行克隆并分析表达模式。本研究从生态和分子水平上分析西花蓟马对温度的耐受性，这为理解其扩散及适应机制提供理论依据，为今后的预测分布及综合治理提供指导。论文主要研究结果如下:
　　1.通过比较西花蓟马不同性别和不同虫态在高低温下暴露1个小时后的成活率，分析长期恒温（26±1℃）饲养后的种群温度耐受性变化。结果表明，在经历长期的恒温饲养后，西花蓟马的雌虫、雄虫和二龄若虫对温度耐受性在一定程度上都有所提高。低温胁迫下，成虫和若虫种群的初始致死低温由-8℃降低到了-11℃，雌虫、雄虫和若虫的半致死低温由-12.5、-11.5和-12.8℃分别降低到-13.2、-13.8和-13.3℃;高温胁迫下，成虫和若虫的初始致死高温由33℃上升到37℃，雌虫、雄虫和若虫的半致高温分别上升了1.1、2.8和3.3℃。
　　2.通过Illumina测序平台对低温(-13℃)、高温(40℃)和常温对照(26℃)处理下的西花蓟马进行转录组测序，组装拼接共获得了79，516个基因，与Nr(Non-redundant，非冗余)数据库比对，共成功注释28，765个基因。对三个转录组样本进行两两差异基因比较后发现，-13℃VS26℃转录组中差异表达的基因共有134个，其中上调60个，下调74个;40℃VS26℃转录组中差异表达的基因共有333个，其中上调153个，下调180个;40℃VS-13℃转录组中差异表达的基因共有230个，上调162个，下调68个。
　　3.基于转录组数据库HSP70s unigene片段信息，采用RT-PCR(Real-time PCR)和RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术，克隆获得3个包含完整开放阅读框(Opening Reading Frame，ORF)的西花蓟马HSP70s基因cDNA序列，分别命名为Fohsp703(KY914546),Fohsc704(KY914547)和Fohsc705(MF377626)。这三条序列全长分别为2，106、3，048和1，917bp，开放阅读框分别为2，040、2，073和1，476bp，编码679、690和491个氨基酸。不同于已经报道的HSP70s，这三个蛋白分别以APAA、EKKN和GIFL结尾。多序列比对分析发现，FoHSP704和FoHSP705与其它物种HSP70相似性高，FoHSP703与其它物种HSP70相似性偏低。系统进化树分析表明，这三个蛋白与先前研究过的FoHSP70分布在不同的四个支上。通过比对基因组序列和cDNA序列发现，Fohsp703无内含子，Fohsc704和Fohsc705分别含有4个和6个内含子。
　　4.采用qRT-PCR技术研究了西花蓟马Fohsp703和Fohsc704在高低温胁迫和不同性别及发育阶段条件下的表达情况，结果表明高低温胁迫都能诱导这两个基因表达，但表达情况各不相同。低温胁迫条件下，相对于雄虫、蛹和若虫，Fohsp703和Fohsc704在雌虫中的表达水平最高，尤其是在-10、-12和-14℃。在高温胁迫条件下，Fohsp703在二龄若虫处于37和39℃时表达水平最高;Fohsc704在成虫中差异不显著，但当蛹处于35℃及二龄若虫处于37℃时表达量较高。

目录

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 温度胁迫与昆虫的关系

1．1．1 温度对昆虫的直接影响

1．1．2 温度对昆虫的间接影响

1．2 昆虫对温度胁迫的适应性机制

1．3 西花蓟马研究概况

1．4 温度胁迫对西花蓟马影响的研究进展

1．5 转录组学及高通量测序技术的研究进展

1．5．1 转录组测序及其研究进展与应用

1．5．2 转录组测序技术在昆虫学上的应用

1．6 热激蛋白的研究概况

1．6．1 热激蛋白简介

1．6．2 热激蛋白的分类及主要功能

1．6．3 热激蛋白在昆虫中的研究

1．7 本论文的研究意义及主要内容

第二章 长期恒温驯化对西花蓟马温度耐受性的影响

2．1 材料和方法

2．1．1 供试虫源

2．1．2 低温处理

2．1．3 高温处理

2．1．4 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 低温暴露处理

2．3．1 高温暴露处理

2．4 小结与讨论

2．4．1 西花蓟马不同性别及发育阶段耐寒性差异

2．4．2 西花蓟马不同性别及发育阶段耐热性差异

2．4．3 西花蓟马原始种群和饲养种群的温度耐受性差异

第三章 温度胁迫对西花蓟马影响的转录组分析

3．1 材料与方法

3．1．1 供试昆虫与处理

3．1．2 RNA的抽提

3．1．3 实验流程

3．1．4 转录组信息处理与分析

3．1．5 qRT-PCR验证

3．1．6 数据分析

3．2 转录组测序结果与分析

3．2．1 样品质检

3．2．2 转录本的拼接及unigene长度分布

3．2．3 转录组测序结果与分析

3．2．4 定量验证

3．3 讨论

第四章 西花蓟马HSP70s基因的克隆及其序列分析

4．1 实验材料

4．1．1 供试虫源

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法与步骤

4．2．1 西花蓟马总RNA的提取

4．2．2 cDNA第一链的合成

4．2．3 西花蓟马3个hsp70s片段的获得、回收纯化及克隆

4．2．4 西花蓟马hsp70s基因的5＇和3＇RACE片段的获得

4．2．5 西花蓟马hsp 70s的基因组扩增

4．2．6 西花蓟马hsp70s的生物信息学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 西花蓟马hsp70s的序列特征分析

4．3．2 西花蓟马HSP70序列比对及系统发育分析

4．3．3 西花蓟马HSP70s的基因组结构分析

4．3 讨论

第五章 西花蓟马HSP70s基因的表达模式分析

5．1 实验材料

5．1．1 供试昆虫及温度处理

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 实验方法与步骤

5．2．1 西花蓟马总RNA的提取

5．2．2 实时定量cDNA的合成

5．2．3 实时定量引物的设计与合成

5．2．4 西花蓟马hsp70s基因实时定量分析

5．2．5 数据处理

5．3 西花蓟马hsp70s的表达模式分析

5．4 讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的研究论文

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