RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除及其功能初探

摘要

RNA甲基化作为一种表观遗传标记，在基因调控中发挥着重要作用。至今为止，已发现RNA存在着100多种修饰，其中甲基化是主要的修饰形式，6-甲基腺嘌呤(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)是最具有代表性的两种甲基化修饰。有研究表明RNAm5C修饰在生物体的发育以及癌症的发生中起重要作用。最初被认为是DNA甲基转移酶的TRDMT1(tRNA aspartic acid methyltransferase1)近十年来被证实是RNA m5C甲基转移酶，催化tRNA产生5-甲基胞嘧啶修饰。最近有研究发现TRDMT1基因对器官形成、生物体的发育以及疾病的发生有影响。然而，对TRDMT1调控这些过程的分子机制尚不清楚。
　　本研究利用CRISPR/Cas9诱导的同源重组技术在RNA甲基化酶TRDMT1基因的转录起始位点上敲入转录终止序列BGH ploy(A)，终止TRDMT1的表达从而达到敲除的目的。通过构建TRDMT1敲除的HEK293细胞系，研究TRDMT1去表达对细胞表型以及其他基因表达的影响，从而了解TRDMT1基因的功能，为研究RNAm5C甲基化的功能提供新思路。主要的研究方法与结果如下:
　　1、建立RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系
　　首先，针对TRDMT1第一个外显子设计并筛选出具有高基因编辑效率的sgRNA表达载体，并构建含有抗性筛选基因(PuroR和NeoR)和转录终止序列BGH ploy(A)的同源重组Donor载体。其次利用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组将Donor序列敲入TRDMT1基因的第一个外显子前，利用嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)对转染的HEK293细胞进行筛选。最后通过RT-qPCR鉴定TRDMT1的表达情况。结果表明TRDMT1基因发生了转录终止，且细胞株TRDMT1转录终止效率达到了99％，最终确认成功获得了TRDMT1敲除的HEK293细胞系(命名为:HEK293-TRDMT1-Knowdown，HEK293-TKO)。
　　2、TRDMT1敲除与恢复对细胞表型的影响
　　研究敲除TRDMT1基因对HEK293细胞表型的影响，对HEK293-TKO细胞进行了4个表型观测:细胞周期、细胞生长曲线、细胞划痕以及细胞克隆形成。细胞周期实验结果表明，TRDMT1基因敲除能影响HEK293细胞周期，导致G1期细胞显著减少，G2期细胞显著增加。细胞生长曲线实验结果显示:TRDMT1基因敲除能显著抑制HEK293细胞的增殖，细胞数量在第2-3天达到显著差异(P＜0.05)，在第4-7天达到了极显著差异(P＜0.01)。然而细胞单克隆实验结果说明TRDMT1的敲除对细胞群体依赖性没有影响。细胞划痕实验结果表明，TRDMT1基因敲除抑制了HEK293细胞的迁移能力，12h和24h的迁移距离差异达到极显著水平(P＜0.01）。
　　为研究TRDMT1基因敲除的作用是否可以通过TRDMT1的重新表达来恢复。首先构建并鉴定TRDMT1过表达载体pcDNA3.1-TRDMT1，利用ExFect(R)转染试剂将pcDNA3.1-TRDMT1质粒瞬时转染至HEK293-TKO细胞中;然后对瞬转的HEK293-TKO细胞进行细胞生长曲线实验和细胞划痕实验。结果显示:在HEK293-TKO细胞中重新表达TRDMT1后，恢复了细胞增殖能力以及活性，并同时增强了其迁移能力，进一步证实TRDMT1基因确实对细胞增殖和迁移能力有影响。
　　3、转录组测序及分析
　　为研究TRDMT1基因敲除对HEK293细胞基因表达的影响，对HEK293和HEK293-TKO细胞进行了转录组测序。结果发现HEK293-TKO细胞和HEK293细胞之间存在2352个差异基因，其中有1585个基因上调，767个基因下调。通过GO分析发现差异基因主要富集在有丝分裂细胞周期G2/M期转变、细胞迁移、细胞黏附以及Rho蛋白信号转导等生物过程。差异基因KEGG分析说明差异基因主要富集在RNA剪接、神经配体-受体互作、cAMP信号传导途径、TGF-β信号、NOTCH信号、细胞周期、癌症等相关通路。从这些通路中选取了11个差异基因进行RT-qPCR验证，结果显示与转录组测序一致。TRDMT1敲除后导致NOTCH1、DLL4、CREBBP、FN1基因下调，CIR1、CCNE2、CDK1、TGFB2、UPF3B、ROCK1、ROCK2和APC基因上调，进一步说明TRDMT1与细胞周期、细胞增殖以及迁移密切相关。在TRDMT1敲除型斑马鱼中检测到CREBBPa、NOTCH1和DLL4具有相同的表达趋势，这暗示了TRDMT1介导的RNAm5C甲基化可能通过NOTCH信号通路、cAMP信号传导途径以及癌症相关通路在生物体个体发育过程中起到重要的调控作用。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 RNA甲基化

1．1 RNA甲基化

1．3 N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)

2．1 5-甲基胞嘧啶(m5C)

2．2 RNAs中m5C检测的方法

2．3 5-甲基胞嘧啶甲基转移酶(m5C-MTase)以及去甲基化酶

2．4 m5C在不同细胞RNA中分布以及生物学意义

3 RNA甲基化酶TRDMT1

3．3 TRDMT1酶的表达和调控

4 CRISPR／Cas9系统

4．1 CRISPR／Cas9系统的由来

4．2 CRISPR／Cas9系统的结构和作用机制

4．3 CRISPR／Cas9系统的应用和发展

5 研究目的与意义

第二章 RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的细胞系建立

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要试剂的配制

1．5 相关引物的合成

2 实验方法

2．1 构建TRDMT1-gRNA载体

2．2 构建TRDMT1-LOXN-Puro同源重组载体

2．3 构建TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体

2．4 转染HEK293细胞

2．5 筛选并获得TRDMT1基因去表达的稳定细胞株

3 结果与分析

3．3 RNA甲基化酶TRDMT1基因转录水平检测

4 讨论

5 小结

第三章 TRDMT1基因敲除与恢复对细胞表型的影响

1．3 主要仪器

1．4 主要试剂的配制

2 实验方法

2．1 细胞周期观察

2．2 细胞生长曲线观察

2．3 细胞划痕观察

2．4 单克隆形成观察

2．5 构建TRDMT1基因过表达载体pcDNA3．1 -TRDMT1

2．6 瞬时转染HEK293和HEK293-TKO细胞

2．7 荧光定量PCR检测TRDMT1 mRNA水平变化

2．8 细胞生长曲线实验

2．9 细胞划痕实验

3 结果

3．2 TRDMT1基因敲除抑制HEK293细胞增殖

3．3 TRDMT1基因敲除抑制HEK293细胞迁移

3．5 成功构建pcDNA3．1 (+)-TRDMT1过表达载体

3．7 恢复TRDMT1表达促进细胞增殖

3．8 恢复TRDMT1基因表达促进细胞迁移

4 讨论

5 小结

第四章 TRDMT1基因敲除对基因表达谱的影响

1．1 实验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要试剂的配制

2 实验方法

2．1 转录组高通量测序(transcriptome sequencing)与分析

2．2 在HEK293和HEK293-TKO细胞验证转录组测序结果

2．3 在TRDMT1基因敲除型斑马鱼中验证3个差异基因的表达

3 结果

3．1 差异表达基因筛选

3．2 差异表达基因聚类分析

3．3 差异基因GO富集分析

3．4 差异基因KEGG富集分析

3．5 差异基因在HEK293细胞中的验证

3．6 三个差异表达基因在斑马鱼中的验证

4 讨论

5 小结

全文总结

创新性

研究展望

参考文献

致谢

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