lncRNa-M1ANCR在鸡原始生殖细胞形成过程中的作用机制探究

摘要

原始生殖细胞(primordial germ cell，PGCs)作为配子的祖先细胞，是生殖细胞发育过程中必不可少的。研究PGCs的发生和分化机理对动物种质资源保存、创新利用以及基因修饰鸡的生产等领域具有重要理论和实践意义。
　　PGCs的发生受到许多因素的影响。目前，研究者们已经发现一些关键性的基因、信号通路、生长因子和表观遗传修饰因素对PGCs的发生起重要调控作用。尽管这些因素对于PGCs形成起到了一定的促进作用，但体外诱导PGCs的生成效率并没有得到提高。因此，亟需从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性地探究，深入了解和认识PGCs的形成过程，以期获取能够满足生产研究所需的大量PGCs细胞。
　　随着测序技术和生物信息分析技术的发展，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)在生殖细胞分化与胚胎发育过程中的作用逐渐受到重视。研究lncRNA对PGCs发生的影响及机制，能够为提高PGCs体外生成效率提供新的研究策略。本研究基于前期单细胞高通量测序结果筛选得到鸡PGCs特异表达lncRNA-M1ANCR，利用RNA干扰技术，以家鸡为研究对象，从体内和体外两个水平探究了lncRNA-M1ANCR在PGCs发生过程中的功能和机制，为有效提高PGCs效率提供理论依据和参考。研究结果如下:
　　(1)lncRNA-M1ANCR的全长扩增，细胞定位与编码能力鉴定:基于前期高通量测序筛选得到PGCs特异性表达lncRNA，命名为lncRNA-M1ANCR，通过RACE实验扩增获得lncRNA-M1ANCR全长（共计1115bp），qRT-PCR验证了lncRNA在PGCs中特异性高表达（ESCs:1.021±0.231，PGCs:5.131±1.23，SSCs:1.825±0.828），与转录组测序（ESCs:1.143±0.350，PGCs:37.131±1.053，SSCs:6.825±0.923）结果一致，细胞定位监测发现lncRNA-M1ANCR定位于PGCs细胞质中（细胞核:0.773±0.051，细胞质:3.395±0.583）;生物信息学预测发现lncRNA-M1ANCR的4bp-115bp为开放阅读框序列，构建原核融合表达载体发现该序列在BL菌种中不表达蛋白，表明明lncRNA-M1ANCR不存在编码小肽能力。
　　(2)体内外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能:根据lncRNA-M1ANCR全长序列，设计三个shRNA靶位点，连入pGMLV-SC5干扰载体，转染DF-1细胞后通过定量检测发现3号靶位点的干扰效率（67.16％±2.0％）最高且显著高于对照组(P＜0.01);同时，克隆lncRNA-M1ANCR全长，构建pcDNA-M1ANCR过表达载体;然后，将lncRNA-M1ANCR慢病毒干扰载体与过表达载体分别转染鸡ESCs，在RA诱导条件下，观察细胞分化形态的变化，结果发现，干扰lncRNA后，类PGCs形成数量（3±1/400×视野）较RA单独诱导组（10±2个/400×视野）和过表达组（12±2个/400×视野）显著减少;进一步采用qRT-PCR检测PGCs细胞特异性标记基因Cvh和C-kit的表达水平发现，干扰组的表达量（Cvh:1.029±0.062，C-kit:1.154±0.009）显著低于过表达组（Cvh:1.672±0.123，C-kit:2.232±0.029）和诱导组（Cvh:1.232±0.234，C-kit:1.561±0.017）(P＜0.01)，而全能性基因Nanog的表达（Nanog:1.029±0.024）则显著高于过表达组(Nanog:0.918±0.038)与诱导组(Nanog:0.984±0.033)(P＜0.01);间接免疫荧光检测结果表明，干扰组Cvh的表达显著低于RA诱导组和过表达组;流式细胞检测发现，干扰组诱导4d后产生的类PGCs细胞（3.96％±0.32％）显著少于RA诱导组（9.67％±0.24％）和过表达组（12.1％±0.46％）(P＜0.01);体内实验中，将干扰载体与过表达载体通过血管注射整合进入鸡胚后，检测生殖标记基因在PGCs的表达情况，发现均出现显著性下降（Cvh:2.631±0.208，C-kit:3.028±0.23）(P＜0.01)，同时通过石蜡切片观察PGCs细胞在生殖嵴的数量，发现干扰组PGCs的形成明显减少（15±0.57个）;为进一步说明lncRNA对PGCs形成的影响，流式细胞分选仪检测干扰lncRNA后PGCs的形成被抑制(4.0％±1.1％)，与体外诱导结果一致。结果表明，lncRNA-M1ANCR对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有正向调控作用。
　　(3)lncRNA-M1ANCR启动子核心区域鉴定与转录因子分析:根据RACE结果预测lncRNA-M1ANCR启动子区域并构建真核表达载体p0-EGFP，转染DF-1细胞发现，克隆片段能够稳定表达绿色荧光，确定该区域具有启动子活性;分别构建启动子缺失载体pGL3-p1-783，pGL3-p2-530，pGL3-p3-269与pGL3-p3x后，转染DF-1细胞，进行双荧光素酶报告检测，结果表明，pGL3-p3-269的启动活性最高（4.39±0.35），说明在-269bp～-1bp中存在重要的调控作用元件，对启动子活性具有重要影响。进一步通过生物信息学分析获知，在启动子区域-269bp～-1bp间存在转录因子p53的结合位点，为探究p53对启动子活性是否具有调控作用，本研究构建了p53的干扰载体与过表达载体。分别转染DF-1细胞后检测缺失片段的双荧光素酶活性，发现干扰p53后核心区域的活性（1.65±0.53）显著低于正常组(4.06±0.41)和过表达组（4.55±0.66）。综上表明，转录因子p53能够调控lncRNA-M1ANCR启动子核心区域的活性，进而调控lncRNA的表达。
　　(4)lncRNA-M1ANCR与gga-mir-1591竞争性结合抑制机制的初步探究:lncRNA具有潜在的ceRNA特性，本研究通过生物信息学分析得到与lncRNA-M1ANCR存在潜在竞争性结合关系的miRNA（gga-mir-1591，gga-mir-3539），分别构建miRNA的模拟物与抑制物，并在RA诱导条件下体外转染鸡ESCs细胞，通过细胞形态观察发现，抑制gga-mir-1591的表达能够促进类PGCs的形成，而模拟gga-mir-1591的表达则干扰类PGCs的形成，gga-mir-3593的模拟物与抑制物对类PGCs的形成无明显作用;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR，MAPK1，全能性基因以及生殖标记基因的表达，发现转染gga-mir-1591抑制物后，MAPK1与lncRNA的表达显著上调（MAPK1:12.293±2.012，lncRNA-M1ANCR:2.137±0.324），生殖标记基因的表达量（Cvh:6.731±0.921，C-kit:6.631±0.918）也显著高于其他组别;为进一步验证gga-mir-1591对鸡PGCs形成的影响，本研究通过流式分析检测发现，抑制gga-mir-1591后，类PGCs的阳性细胞率（3.13±0.22％）显著高于其他组别(P＜0.01)，表明miRNA gga-mir-1591对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有调控作用，与lncRNA-M1ANCR可能存在竞争性结合抑制关系。为进一步验证gga-mir-1591与lncRNA-M1ANCR之间的关系，本研究在转染gga-mir-1591模拟物与抑制物的基础上，分别转染了lncRNA-M1ANCR的过表达载体与干扰载体，通过拯救实验来验证两者之间存在的竞争性结合抑制关系。细胞形态学观察结果发现，抑制gga-mir-1591后类PGCs的形成能够受lncRNA干扰载体的影响，导致类PGCs形成减少，反之亦然;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR，MAPK1，全能性基因以及生殖标记基因的表达发现，在抑制gga-mir-1591表达同时干扰lncRNA情况下，MAPK1的表达量较抑制gga-mir-1591组显著降低(P＜0.01)，生殖标记基因的表达也有显著下降(P＜0.05);综上表明，gga-mir-1591与lncRNA-M1ANCR存在竞争性结合关系，lncRNA-M1ANCR通过“海绵样”吸附的方式，竞争性结合靶向作用于MAPK1的miRNA gga-mir-1591，调控MAPK1的表达水平，进而调控鸡PGCs的形成。
　　(5)lncRNA-M1ANCR互作蛋白的筛选与鉴定:通过对lncRNA-M1ANCR的RNApull down结果分析得到，在鸡ESCs向PGCs分化过程中lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白存在潜在相互作用关系，为进一步验证两者之间的作用机制，本研究通过Western Blot实验确定了ILF3蛋白在鸡PGCs中存在表达，并通过RIP实验发现，ILF3与lncRNA间存在结合。为了进一步探究两者之间的互作关系，本研究对与ILF3与lncRNA相关的下游信号通路的关键节点基因进行了qRT-PCR检测，结果表明干扰lncRNA后，下游信号通路关键基因MAPK与Wnt(MAPK:10.342±1.192，Wnt:6.323±0.624)较过表达组(MAPK:14.432±1.394，Wnt:10.960±0.934)显著降低。综上表明，在鸡PGC的形成过程中，lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白间存在互作关系，并且lncRNA表达的变化能够影响下游信号通路关键基因的表达。

目录

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 原始生殖细胞

1．1 PGCs的生物学特性

1．2 PGCs的起源与迁移

1．3 PGCs的分离培养与体外诱导

1．4 PGCs形成的调控机制

2 长链非编码RNA研究进展

2．1 长链非编码RNA概述

2．2 lncRNA的调控机制

2．3 lncRNA与细胞分化

3 本研究的目的与意义

参考文献

第二章 lncRNA-M1ANCR的鉴定与理化性质分析

1 实验材料与方法

1．1 实验材料与试剂

1．2 实验方法

2 实验结果

2．2 RACE实验获得lncRNA-M1ANCR全长

2．3 lncRNA-M1ANCR序列生物信息学分析

2．4 lncRNA-M1ANCR在组织与细胞中的表达检测

2．5 lncRNA-M1ANCR蛋白编码能力的鉴定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 lncRNA-M1ANCR在鸡PGCs生成过程中生物学功能探究

1 材料与方法

1．1 实验材料与试剂

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 lncRNA-M1ANCR慢病毒干扰载体的构建与活性检测

2．2 lncRNA-M1ANCR过表达载体的构建与活性检测

2．3 体外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能

2．4 体内研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 启动子对lncRNA-M1ANCR表达的影响

1 实验材料与方法

1．1 实验材料与试剂

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 真核表达载体pMlANCR-EGFP与启动子各缺失片段载体的构建

2．2 lncRNA启动子活性定性分析

2．3 lncRNA启动子核心区域分析

2．4 p53基因干扰载体与过表达载体的构建与活性检测

2．5 转录因子p53对启动子活性的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 lncRNA-M1ANCR影响PGCs形成的分子机制初探

1 实验材料与方法

1．1 实验材料与试剂

1．2 实验方法

2 实验结果

2．1 基于RNA pull down技术筛选lncRNA-MlANCR互作蛋白

2．2 lncRNA- M1ANCR与miRNA竞争性结合抑制机制初探

2．3 实时荧光定量检测MAPK信号通路关键基因表达变化

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论与创新

全文结论

全文创新点

致谢

附录

研究生期间发表的论文

声明