Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡及与Setd8相互作用的初步研究

摘要

Stra8(stimulated by retinoic acid gene8，Stra8)，是视黄酸(retinoic acid，RA)诱导基因之一，对于减数分裂启动和男性生殖发育具有重要作用。Stra8在正在分化的精原细胞到前细线期精母细胞表达。而且Stra8在细胞核与细胞质均具有定位，并根据发挥功能的不同在核质之间穿梭。Stra8敲除小鼠不育，但其在精子发生中的作用及机制尚未阐明。本课题通过以下两个部分研究Stra8在精子发生中的作用与机制:第一，Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。第二，体外研究Stra8与Setd8的相互作用。该研究为揭示Stra8在精子发生中的作用奠定了基础。
　　本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。
　　（一）通过体内和体外实验，发现并鉴定Stra8在精子发生中具有抑制细胞凋亡的作用。在Stra8KO小鼠模型、维生素A缺乏小鼠(VAD)及VAD恢复小鼠（VAR）中发现Stra8具有抑制凋亡的作用。我们选择11dpp的StraSKO小鼠睾丸进行TUNEL实验并计数凋亡细胞，结果发现:与WT小鼠相比，Stra8KO小鼠生精细胞管内凋亡细胞数量明显增加。其次，构建维生素A缺乏和VAD恢复小鼠模型(VAD and VAR)。通过TUNEL实验发现在45天和61天的VAD小鼠模型中，凋亡细胞明显增加，进一步验证Stra8具有抑制凋亡作用。最后，在Stra8过表达精原细胞验证了Stra8抑制凋亡的作用，应用TUNEL实验和流式细胞术对凋亡细胞进行计数，也发现在Stra8过表达精原细胞内凋亡细胞数量明显减少。
　　（二）通过基因微阵列分析，探索Stra8抑制细胞凋亡的机制及相关通路。通过基因微阵列分析，我们发现了5个上调基因和4个下调基因与细胞凋亡相关。通过qRT-QCR验证与文献查阅发现，在这些DEGs中，PDK1（AKT重要上游因子）、ANG2（BCL2抑制因子）、USP33、TCF4、GSTP1（MAPK相关因子）、OSGIN1（P53相关因子）和Caspase3与AKT信号通路相关，同时BCL2、P53、ERK(MAPK1/3)、JNK(MAPK8/9)和P38(MAPK14)是AKT信号通路的关键因子。
　　（三）Stra8在精子发生中抑制凋亡作用的潜在通路绘制。我们进一步在mRNA和蛋白水平检测发现，与对照组相比，Stra8过表达精原细胞内PDK1、AKT、BCL2和ERK的表达水平均明显升高，P53mRNA表达水平显著降低，但其蛋白表达没有明显差别。同时，通过检测发现，与对照组相比，Stra8过表达精原细胞内Caspase3在mRNA和蛋白水平均表达降低。因此，Stra8可能通过AKT通路直接或间接抑制P53或激活BCL2家族基因，与MAPK通路相互作用，进而抑制caspases家族基因，发挥抑制凋亡作用。
　　第二部分 体外研究Stra8与Setd8的相互作用。
　　（一）Stra8过表达精原细胞和P19细胞中Stra8、Setd8和H4K20me1的表达。应用WB检测Stra8过表达精原细胞内Setd8和H4K20me1的表达发现，与对照组相比，在Stra8过表达精原细胞中，Set8表达降低，而H4K20me1表达增高，提示三者之间可能具有相互调控关系。之后，我们应用4μM RA诱导P19细胞36-48hr，使其瞬时过表达Stra8，然后检测诱导后P19细胞内Set8和H4K20me1的表达，结果发现，与未诱导P19相比，RA诱导P19细胞分化后，Set8表达水平降低，而H4K20me1表达增高，与在Stra8过表达精原细胞的表型一致，进一步验证三者之间具有相互调控关系。
　　（二）Stra8过表达细胞株的细胞周期同步化方法的建立。由于Stra8、Setd8和H4K20me1的表达与细胞周期相关。因此我们参照Hela细胞的细胞周期同步化方法，将Stra8过表达精原细胞同步化至细胞周期的不同阶段。首先，应用血清剥夺法同步化Stra8过表达精原细胞至G1期，分别血清剥夺培养细胞24，36，48，60，72，84，96hr，发现血清剥夺培养72hr后，细胞周期同步化至G1期效率最高，达60-70％。其次，应用“二次胸苷(2.5mM)阻滞法”同步化Stra8-GC1至S期，第二次释放时间分别为0，3，6，9hr,发现二次释放时间3hr后细胞的S期同步化效率最好，达60-70％。最后，应用100ng/ml诺考达唑分别处理4，8，12hr，发现处理8hr后细胞的M期同步化效率最好，达90％以上。
　　（三）Stra8，Setd8和H4K20mel在Stra8过表达细胞株在细胞周期不同阶段的表达。我们应用细胞免疫荧光和Western Bloting法检测Stra8过表达精原细胞细胞周期不同阶段Stra8，Setd8和H4K20me1的表达，发现在Stra8-GC1内，Stra8表达在G1期低，S期达到高峰，信号核质均有，在G2/M期表达降低;Setd8表达在G1期无表达，在S期后期开始表达，信号主要在细胞核，在G2/M期表达水平达高峰;H4K20me1表达模式与Setd8表达相似。经过表型分析与文献查阅我们猜测在细胞周期S期中，Stra8抑制E3泛素连接酶相关基因表达，CRL4Cdt2，SCFSkp2等，减弱其对Set8的降解作用，导致Setd8总体表达下降;而由于H4K20me1提前表达，反而导致H4K20me1总体表达水平提高。

目录

摘要

符号说明

第一部分：Stra8在精子发生中抑制凋亡作用机制的初步探索

前言

实验材料

一、细胞株

二、实验动物

三、实验仪器

四、实验相关试剂与配制

实验方法

一、细胞培养

二、TUNEL

三、流式细胞仪检测细胞凋亡：Annexin V／PI双染色法

四、使用基因芯片分析凋亡差异表达基因

五、qRT-PCR

六、Western blot

七、统计学分析

实验结果

一、在Stra8 KO小鼠模型中发现Stra8抑制凋亡作用

二、在VAD和VAR小鼠模型中验证Stra8抑制凋亡作用

三、在Stra8过表达精原细胞验证Stra8抑制凋亡的作用

四、Stra8抑制凋亡的机制研究

讨论

第二部分：体外细胞系中Stra8与Setd8相互作用分析

前言

实验材料

一、细胞株

二、实验仪器

三、实验相关试剂与配制

实验方法

一、RA诱导P19细胞分化

二、Stra8过表达精原细胞的细胞周期同步化

三、细胞免疫荧光法

四、统计学分析

实验结果

一、Stra8过表达精原细胞中Stra8，Setd8和H4K20me1的表达分析

二、RA诱导P19细胞分化后Stra8，Setd8和H4K20me1的表达分析

三、Stra8过表达细胞株的细胞周期同步化方法的建立与鉴定

四、Stra8过表达细胞株不同周期Stra8，Setd8和H4K20me1的表达

讨论

总结

参考文献

综述 雄性小鼠联会复合体的研究进展

致谢

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