CD19+Tim-1+IL-10+调节性B细胞参与日本血吸虫感染及肝脏病变的研究

摘要

日本血吸虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，仍是我国主要的公共卫生问题之一。血吸虫感染免疫的一个基本特征是在成虫产卵后，宿主逐渐表现出免疫下调的状态，使感染呈现慢性化。以往的研究认为这种免疫负调节性与调节性T细胞(Tregs)、DC和Mψ等相关。调节性B细胞(Bregs)是一类具有调节功能的B细胞，在自身免疫病、慢性炎症、肿瘤、寄生虫感染等疾病中发挥着免疫负向调控作用。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-25个核苷酸的小RNA，不编码蛋白但其在细胞内具有多种重要的调节作用。近来研究发现，microRNA在B细胞的活化、分化和发挥功能过程中起着关键作用，但目前仍不清楚miRNA是否在B细胞发挥调节性功能中发挥重要作用。本课题组前期研究已经证实日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)在体内外均能诱导产生Bregs并分泌高水平的IL-10，并且在日本血吸虫感染过程中，可以诱导产生CD19+Tim-1+分泌IL-10的B细胞。那么，是否miRNA参与日本血吸虫感染诱导Bregs发育分化仍不清楚。日本血吸虫病主要病理改变为肝脏肉芽肿，在慢性期导致肝脏纤维化。研究表明在肝脏肉芽肿形成过程中，B细胞发挥了重要作用。但是，目前仍不清楚调节性B细胞是否参与了肝脏的病理改变。因此，我们对日本血吸虫感染小鼠后调节性B细胞的产生及其作用进行了初步研究。
　　研究内容分为以下3个部分:
　　1、miRNA-21在日本血吸虫诱导调节性B细胞分化过程中的作用
　　目的:探索miRNA-21在日本血吸虫感染小鼠后调节性B细胞分化及体外SEA刺激后调节性B细胞的产生中的作用。
　　方法:构建日本血吸虫感染C57BL/6小鼠模型，分别取感染13W和正常小鼠脾脏CD19+B细胞，qPCR检测miRNA-21和IL-10mRNA表达水平。体外用SEA、LPS分别刺激正常小鼠CD19+B细胞72h，荧光定量PCR检测CD19+B细胞miRNA-21和IL-10的mRNA水平。体外miRNA-21-Inhibitor转染正常小鼠CD19+B细胞后用SEA、LPS刺激72h，流式检测IL-10+B细胞的比例，ELISA检测上清中IL-10的水平。
　　结果:日本血吸虫感染后，小鼠脾脏B细胞miRNA-21和IL-10的mRNA的表达水平较正常小鼠明显升高;体外SEA、LPS刺激CD19+B细胞后miRNA-21和IL-10的mRNA水平也明显升高;体外miRNA-21-Inhibitor转染正常小鼠CD19+B细胞后用SEA、LPS刺激72h，IL-10+B细胞比例及IL-10分泌量显著降低。
　　结论:日本血吸虫感染后，miRNA-21参与了调节性B细胞的产生和IL-10分泌。
　　2、日本血吸虫感染诱导肝脏肉芽肿形成过程中调节性B细胞的动态变化
　　目的:通过体内实验观察日本血吸虫感染不同阶段CD19+Tim-1+IL-10+B细胞的动态变化。
　　方法:构建日本血吸虫感染C57BL/6小鼠模型，分别在感染第0W，3W，6W，13W分离小鼠脾脏单个核细胞和肝脏淋巴细胞，流式检测CD19+Tim-1+IL-10+B细胞比例，同时取感染不同阶段的小鼠肝脏免疫组化分析CD19+Tim-1+细胞的变化。
　　结果:小鼠日本血吸虫感染后第6W、13W脾脏CD19+Tim-1+IL-10+B细胞比例显著增加;感染后第3W、6W，小鼠肝脏CD19+Tim-1+IL-10+B细胞比例均显著增加;感染第13W，小鼠肝脏CD19+Tim-1+IL-10+B细胞显著减少。肝脏免疫组化分析发现，感染第6W小鼠肝脏有严重的虫卵肉芽肿，并伴随有大量CD19+Tim-1+细胞聚集在肉芽肿周围;感染第13W小鼠肉芽肿体积有所减小，肉芽肿周围CD19+Tim-1+细胞也明显减少。
　　结论:日本血吸虫感染早期和急性期，CD19+Tim-1+IL-10+B细胞参与了日本血吸虫感染诱导的肝脏肉芽肿的发生与发展。
　　3、SEA诱导产生的调节性B细胞对巨噬细胞的作用的初步研究
　　目的:体外实验初步探讨调节性B细胞对巨噬细胞的作用。
　　方法:磁珠分选正常小鼠CD19+B细胞，体外分别用LPS、SEA刺激培养后与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养，检测培养上清中NO和IL-10水平。荧光定量检测共培养后RAW264.7细胞iNOS和Arg-1的mRNA水平。
　　结果:与阴性对照组相比，经SEA刺激后的B细胞与RAW264.7细胞共培养后，NO表达无明显变化，IL-10表达显著增加，iNOS的mRNA表达水平无明显变化，Arg-1的mRNA水平显著升高。
　　结论:体外SEA刺激的B细胞能够诱导巨噬细胞分化成M2型的巨噬细胞。

目录

摘要

缩略词表

前言

第一部分：miRNA-21在日本血吸虫诱导调节性B细胞分化过程中的作用

1 实验材料

2 仪器与耗材

3 实验方法

4 统计分析

5 结果

6 讨论

参考文献

第二部分：日本血吸虫感染诱导肝脏肉芽肿形成过程中调节性B细胞的动态变化

1 实验材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5 讨论

参考文献

第三部分：SEA诱导产生的调节性B细胞对巨噬细胞的作用的初步研究

1 实验材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5 讨论

参考文献

文献综述

致谢

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